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Martinez Ceballos, Alvaro (2017) Nanoproteomics. Interaction of gold nanoparticles with proteins. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Specific and reliable protein sensing and detection is a challenge of increasing interest due to their role as biomarkers in many diseases. Classical proteomics require time-consuming separation techniques and lacks the capability to assess protein activity variations uncorrelated to expression levels. Activity-based protein profiling (ABPP) is a strategy in which chemical probes (irreversible protein inhibitors) are covalently bound to target proteins with a shared activity and some signal arising from the probe is quantified, being sensitive to protein activity due to the binding step. Nonetheless, protein separation is still expensive in terms of time or requires the use of high-cost instrumentation.

Our proposal was to employ gold nanoparticles as a tool for covalently capturing proteins of interest and separating them with ease from the remaining proteome by size-differentiation.
Mixed monolayer nanoparticles have been obtained by two different methods, by direct substitution on an homogeneous monolayer or by supramolecular click-coupling reactions onto azido-functionalized derivatives. The two strategies were shown to be complementary; thiol exchange is simpler but substitution yields are difficult to predict when new thiols are tested whereas reliable click-coupling onto pre-substituted azido-nanoparticles requires the use of dibenzocyclooctyne derivatives to obtain high yields.

We have developed and fully characterized supramolecular conjugates of gold nanoparticles with a thiol-based mixed-monolayer that endow the nanoparticles with high water solubility but also the capability to expose the targeting moiety on their surface.

Avidin-biotin interaction has been chosen as model system to prove the capability of functionalized nanoparticles to effectively reach protein active sites and displace small molecules from their binding site in competition assays.

On the other hand, supramolecular architectures based on chain-like arrays of nanoparticles have been prepared and shown to fuse in water to form nanorods or nanowires by treatment with glucosamine phosphate. Addition of thiol during the incubation stop nanoparticle fusion, opening the possibilities for a potential synthetic method to obtain anisotropic systems for NIR sensing.

Abstract (italiano)

Rilevare e riconoscere proteine in modo specifico ed affidabile costituisce una sfida di crescente interesse a causa del ruolo che esse hanno come marcatori in molte malattie. La proteomica classica richiede tecniche di separazione assai dispendiose in termini di tempo e manca della capacità di correlare le variazioni di attività delle proteine che non siano legate ai loro livelli di espressione. L’identificazione di proteine sulla base della loro attività (activity-based protein profiling, ABPP) è una strategia in cui una specifica molecola (tipicamente un inibitore irreversibile della proteina) viene coniugata mediante un legame covalente alle proteine bersaglio caratterizzate da attività simile. Mediante un ‘reporter’, quale ad esempio un gruppo fluorescente, è possibile seguire il processo di coniugazione e rilevare la presenza delle proteine . Tuttavia, la separazione delle proteine coniugate dal resto del proteoma è ancora costosa sia in termini di che strumentali.

La mia proposta era di impiegare nanoparticelle di oro come strumenti per catturare in modo covalente proteine di interesse separandole poi con facilità dal proteoma in ragione della loro diversa dimensione.

Ho ottenuto nanoparticelle di oro passivate da un monostrato a composizione mista mediante due approcci sintetici diversi, rispettivamente mediante sostituzione diretta su un monostrato omogeneo o mediante reazioni di coniugazione utilizzando cicloaddizioni tipo’click’ sul sistema supramolecolare sfruttando derivati azido-funzionalizzati. Le due strategie hanno dimostrato di essere complementari. Lo scambio di tioli è più semplice, ma il grado di scambio è difficile da prevedere quando si usano nuovi tioli. Al contrario le reazioni di cicloaddizione ‘tipo click’ sono affidabili quando si usano derivati del dibenzocicloottino, ma richiedono una pre-funzionalizzazione del monostarto della nanoparticella.

Ho sintetizzato e completamente caratterizzato sistemi supramolecolari costituiti da nanoparticelle di oro con monostrato misto ancorato sulla superficie dell’oro mediante un gruppo tiolico e dotate non solo di elevata solubilità in acqua, ma anche della capacità di esporre la porzione di targeting sulla loro superficie.

Ho scelto l’interazione avidina-biotina come sistema modello per verificare la capacità delle nanoparticelle funzionalizzate di raggiungere in modo efficace il sito attivo di una proteina e di spostare eventuali substrati presenti nel loro sito di riconoscimento.

In fine, ho realizzato architetture supramolecolari basate su array concatenati di nanoparticelle e ho dimostrato che essi sono in grado di fondersi tra di loro in acqua per formare nanotubi o nanofili in seguito al trattamento con glucosamina fosfato. L'aggiunta di tiolo, stabilizzando la struttura che si è formata durante la fusione delle nanoparticelle, previene l’ulteriore crescita, aprendo la possibilità ottenere sistemi anisotropi con caratteristiche spettroscopiche molto interessanti e potenzialmente sfruttabili per ‘sensing’ nel vicino IR (NIR).

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Scrimin, Paolo Maria
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 29 > Corsi 29 > SCIENZE MOLECOLARI
Data di deposito della tesi:27 Gennaio 2017
Anno di Pubblicazione:27 Gennaio 2017
Parole chiave (italiano / inglese):Gold nanoparticles, proteomics, protein targeting, nanorods
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/06 Chimica organica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chimiche
Codice ID:10005
Depositato il:14 Nov 2017 15:15
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