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DADOUSIS, CHRISTOS (2017) From milk to cheese: genomic background, biological pathways and latent phenotypes of bovine cheese-related traits. [Ph.D. thesis]

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PDF Document (PhD Thesis)

Abstract (english)

The aim of this PhD thesis was the study of the genomic, biological and phenotypic background of bovine cheese-related traits. The primary goal of this PhD thesis was to unravel the genomic background of bovine milk technological and cheese-related traits to specific chromosomic regions (CHAPTERS 1 to 3). To achieve this, the cow’s ability to produce cheese was decomposed into 11 milk coagulation (MCP) and curd-firming properties (CFt), and 7 cheese yield and milk component recoveries into the curd (REC) traits. Besides, to tackle the problem of the large number of variables required to describe the cow’s ability to produce cheese, posing restrictions in the construction of selection indices, and thereby selection decisions, factor analysis (FA) was used (CHAPTERS 4 and 5).
The MCP traits were: 3 traditional single point lacto-dynamographic properties (RCT: rennet coagulation time, min; k20: time to a curd firmness (CF) of 20 mm, min; a30: CF 30 min after rennet addition), 6 parameters modeling 360 CF data for each milk sample (CFP: potential asymptotic CF at infinite time, mm; kCF: curd firming instant rate constant, %×min-1; kSR: syneresis instant rate constant, %×min-1; RCTeq: RCT from modeling; CFmax: maximum CF, mm; tmax: time at CFmax, min), milk- protein (%) and pH. The 3 CY traits were the weight (wt) of fresh curd (%CYCURD), curd solids (%CYSOLIDS), and curd moisture (%CYWATER) as % of wt of milk processed. The 4 REC (RECFAT, RECPROTEIN, RECSOLIDS, and RECENERGY) were calculated as the % ratio between the nutrient in curd and the corresponding nutrient in processed milk. For FA 26 traits related to milk yield and quality (including milk protein fractions), MCP-CFt and CY-REC traits were analyzed.
Single marker genome-wide association analyses (GWAS) complemented by gene-set enrichment and pathway-based analyses were conducted. In total, 1,152 Italian Brown Swiss cows reared in 85 herds were genotyped with the Illumina SNP50 Beadchip v.2. Single marker regression GWAS were fitted using the GenABEL R package (GRAMMAR-GC). The Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway databases were queried for the enrichment analyses.
In GWAS (CHAPTERS 1 and 2), sharp peaks were detected on Bos taurus autosome (BTA) 6, at 84 to 88 Mbp, with the highest peak detected at 87.4 Mbp in the region harboring the casein genes and more precisely of κ-CN (CSN3). Marker Hapmap52348-rs29024684 (~87.4 Mbp), closely located to the casein genes on BTA6, was strongly associated with RECFAT (P = 1.91×10-15) and CFP (P = 1.62×10-17). Evidence of quantitative trait loci at 82.6 and 88.4 Mbp on the same chromosome was found. On BTA11, marker ARS-BFGL-NGS-104610 (~104.3 Mbp) was highly associated with RECPROTEIN (P = 6.07×10-36). Apart from BTA6 and 11, SNP located in 15 more chromosomes (1, 2, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 26, 27 and 28) were significantly associated to the MCP-CFt and CY-REC traits.
The gene-set enrichment and pathway-based analysis (CHAPTER 3) revealed 21 GO and 17 KEGG categories significantly associated (false discovery rate controlled at 5%) with 7 of the traits (RCT, RCTeq, kCF, %CYSOLIDS, RECFAT, RECSOLIDS and RECENERGY), with some being in common between traits. The significantly enriched categories included calcium signaling pathway, salivary secretion, metabolic pathways, carbohydrate digestion and absorption, the tight junction and the phosphatidylinositol pathways, as well as pathways related to the bovine mammary gland health status, and contained a total of 150 genes located in all chromosomes but 9, 20, and 27.
In FA (CHAPTERS 4 and 5), ten mutual orthogonal Fs were obtained using a varimax rotation. The 10 Fs explaining 74% of the original variability. Those Fs captured basic concepts of the “milk to cheese” process. More precisely, the first four Fs, sorted by variance explained, were able to capture the underlying structure of the CY percentage (F1%CY), the CF process with time (F2CFt), the milk and solids yield (F3Yield) and the presence of nitrogen (N) into the cheese (F4Cheese N). Moreover, 4 Fs (F5 αs1-β-CN, F7β-κ-CN, F8αs2-CN, F9αs1-CN-P) were related to the basic milk caseins (as1-CN, as2-CN, β-CN, κ-CN, and the phosphorylated form of as1-CN) and 1 factor was associated with the α-LA whey protein (F10α-LA). A factor describing the udder health status of a cow (F6Udder health), mainly loaded on lactose, other nitrogen compounds and SCS, was also obtained.
In general, FA results were coherent to the given name of the factor. Stage of lactation had a significant effect for the majority of the Fs, followed by parity. Moreover, considerable genetic correlations existed among the Fs (CHAPTER 4). All Fs showed significant associations (P < 5 ×10-5) in GWAS, but F5Yield. High peaks on BTA6 (~87Mbp) and at the tail of BTA11 (~104Mbp) were mainly associated to F6β-κ-CN and F1Cheese N, respectively. In addition, 33 GO terms and 6 KEGG categories were mainly enriched for F8αs2-CN, but also for F1%CY, F4Cheese N, and F10α-LA. Biological pathways were mainly related to the broader categories of ion activity, neurons and the tight junction. Moreover, the considerably large number of enriched GO and KEGG terms for F8αs2-CN suggests that, perhaps, more focus should be given on αs2-CN (CHAPTER 5).

Abstract (italian)

Lo scopo di questa tesi di dottorato è stato lo studio del background genomico, biologico e fenotipico di caratteri legati al processo di caseificazione nella specie bovina. L’obiettivo primario è stato quello di determinare il background genomico di caratteri tecnologici del latte bovino legati al processo di caseificazione (CAPITOLI da 1 a 3). Per raggiungere questo obiettivo, l’abilità della bovina di produrre formaggio è stata ripartita in 26 fenotipi: 11 caratteri di attitudine casearia e proprietà di coagulazione, comprendenti le tradizionali proprietà di coagulazione del latte (MCP) e nuovi parametri modellizzati di consistenza della cagliata (CFt), e 7 fenotipi di resa in formaggio (CY) e recupero dei nutrienti del latte nella cagliata (REC). Tuttavia, l'elevato numero di variabili necessarie per descrivere la produzione di formaggio bovino pone delle restrizioni nella costruzione di indici di selezione, e quindi nel prendere decisioni di selezione. Per superare il problema della elevata dimensionalità, è stata utilizzata un’analisi fattoriale (FA) per studiare la struttura latente dei 26 caratteri coinvolti nel processo di caseificazione (CAPITOLI 4 e 5).
I caratteri MCP includevano le 3 proprietà lattodinamografiche tradizionali basate su singola misurazione dello strumento (RCT: tempo di coagulazione, in min; k20: tempo di rassodamento, in min; a30: consistenza del coagulo (CF) 30 min dopo l'aggiunta del caglio, in mm). I fenotipi CFt comprendevano un set di 6 parametri modellizzati sulla base di 360 dati di CF misurati per ciascun campione di latte (CFp: CF potenziale, in mm; kCF: tasso di rassodamento del coagulo, in % × min-1; kSR: tasso di sineresi, in % × min-1; RCTeq: RCT stimato dal modello; CFmax: massima CF, in mm; tmax: tempo necessario per raggiungere CFmax, in min), delle proteine del latte (%) e del pH. I 3 caratteri CY includevano resa a fresco (% CYCURD), resa in solidi (% CYSOLIDS), e acqua ritenuta nella cagliata (% CYWATER), espresse come percentuale del latte trasformato. Le 4 misure di REC (RECFAT, RECPROTEIN, RECSOLIDS, e RECENERGY) sono state calcolate come rapporto espresso in percentuale tra il valore di nutrienti nella cagliata e il corrispettivo nel latte. L’analisi FA ha considerato tutti i 26 caratteri oggetti di studio, comprendenti produzione e qualità del latte (incluse le frazioni proteiche del latte), parametri CFt e caratteri CY-REC.
La metodologia adottata comprendeva analisi di associazione genome-wide (GWAS), accompagnata da analisi di arricchimento genetico e di tipo pathway-based. Le analisi genomiche hanno considerato un totale, 1.152 bovine di razza Bruna Italiana allevate in 85 allevamenti, genotipizzate attraverso il v.2 Illumina SNP50 Beadchip. Le analisi GWAS sono state condotte mediante analisi di regressione a singolo marcatore, fittate utilizzando il pacchetto GenABEL del software R (GRAMMAR-GC). I database Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sono stati interrogati per le analisi di arricchimento.
Nell’analisi GWAS (CAPITOLI 1 e 2) sono stati individuati picchi nitidi sull’autosoma 6 di Bos taurus (BTA) tra 84-88 Mbp, con il picco più alto rilevato a 87,4 Mbp nella regione ospitante i geni della caseina e più precisamente della κ-CN (CSN3). Il marcatore Hapmap52348-rs29024684 (~ 87,4 Mbp), localizzato in prossimità dei geni della caseina su BTA6, ha mostrato una forte associazione con RECFAT (P = 1.91 × 10-15) e CFP (P = 1.62 × 10-17). Sullo stesso cromosoma, è stata trovata evidenza di loci per i caratteri quantitativi a 82,6 e 88,4 Mbp. Su BTA11, il marcatore ARS-BFGL-NGS-104.610 (~ 104,3 Mbp) è risultato fortemente associato con RECPROTEIN (P = 6,07 × 10-36). Oltre a BTA6 e 11, altri SNP situati in altri 15 cromosomi (1, 2, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 26, 27 e 28) sono risultati significativamente associati con MCP, CFt e con i caratteri CY-REC.
L'analisi di arricchimento e pathway-based (CAPITOLO 3) ha rivelato 21 categorie GO e 17 categorie KEGG significativamente associate (tasso di errore controllato al 5%) con 7 tra i caratteri fenotipici considerati (RCT, RCTeq, kCF, %CYSOLIDS, RECFAT, RECSOLIDS e RECENERGY) e alcune categorie sono risultate in comune tra i caratteri. Le categorie significativamente arricchite includevano vie di segnalazione del calcio, di secrezione salivare, vie metaboliche, di digestione e assorbimento dei carboidrati, di giunzioni occludenti e del fosfatidilinositolo, così come vie legate allo stato di salute della ghiandola mammaria bovina, per un totale di 150 geni situati in tutti i cromosomi tranne 9, 20 e 27.
Nella FA (CAPITOLI 4 e 5) sono stati ottenuti dieci Fs mutualmente ortogonali utilizzando una rotazione varimax. I 10 Fs spiegavano il 74% della variabilità originale. Tali Fs erano biologicamente riconducibili a elementi base del processo di trasformazione “dal latte al formaggio". Più precisamente, i primi 4 Fs, ordinati sulla base della varianza spiegata, sono stati in grado di definire la struttura latente della CY percentuale (F1% CY), del processo di CF nel tempo (F2CFt), del rendimento di latte e solidi (F3Yield) e della presenza di azoto (N) nel formaggio (F4Cheese N). Inoltre, 4 Fs (F5αs1-β-CN, F7β-κ-CN, F8αs2-CN, F9αs1-CN-P) erano associati alle caseine del latte (as1-CN, as2-CN, β-CN, κ-CN, e la forma fosforilata as1-CN) e 1 fattore alla proteina del siero α-LA (F10α-LA). É stato inoltre ottenuto un fattore in grado di descrivere lo stato di salute della mammella bovina (F6Udder health), basato principalmente sulla produzione di lattosio e di altri composti azotati e sulle cellule somatiche.
In generale, i risultati nell’analisi FA sono risultati coerenti con l’attribuzione del significato biologico dato al fattore. La maggior parte degli Fs è risultata significativamente influenzata dallo stadio di lattazione, seguito dall’ordine di parto. Sono state inoltre riscontrate correlazioni genetiche rilevanti tra i fattori (CAPITOLO 4). Nell’analisi GWAS tutti gli Fs hanno mostrato associazioni significative (P <5 × 10-5), ad eccezione di F5Yield. I picchi elevati su BTA6 (~ 87Mbp) e sulla coda di BTA11 (~ 104Mbp) erano principalmente associati a F6β-κ-CN e F1Cheese N, rispettivamente. Inoltre, 33 termini GO e 6 categorie KEGG sono risultati arricchiti e associati con F1% CY, F4Cheese N, F8αs2-CN e F10α-LA. Le vie di segnalazione biologica descritte dai fattori erano principalmente correlate alle categorie più generali di attività ionica, neuroni e giunzioni occludenti. Poichè un numero considerevole di categorie arricchite GO e KEGG è risultato associato al fattore F8αs2-CN, maggiore attenzione dovrebbe essere posta sulla frazioneαs2-CN (CAPITOLO 5).

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Cecchinato, Alessio
Supervisor:Bittante, Giovanni
Ph.D. course:Ciclo 29 > Corsi 29 > SCIENZE ANIMALI E AGROALIMENTARI
Data di deposito della tesi:28 January 2017
Anno di Pubblicazione:28 January 2017
Key Words:milk coagulation and curd firmness, cow cheese ability, genome-wide association, gene-set enrichment, pathway-based analysis, factor analysis
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/17 Zootecnica generale e miglioramento genetico
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Agronomia Animali Alimenti Risorse Naturali e Ambiente
Codice ID:10019
Depositato il:16 Nov 2017 10:00
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