Go to the content. | Move to the navigation | Go to the site search | Go to the menu | Contacts | Accessibility

| Create Account

Montagna, Aldo (2017) Generation and characterization of a new model of OPA1-linked Dominant Optic Atrophy. [Ph.D. thesis]

Full text disponibile come:

PDF Document (Montagna Aldon tesi)

Abstract (english)

Mitochondria are very dynamic organelles with a crucial role in life and death of eukaryotic cells. These organelles regulate cellular energy generation, calcium and redox homeostasis, and apoptosis. To perform the cellular functions effectively, mitochondria continuously change their structure and morphology through protein machineries controlling fission and fusion process (mitochondrial dynamics). Strong evidence has emerged to implicate disturbed mitochondrial fusion and fission as central pathological components underpinning a number of childhood and adult-onset neurodegenerative disorders. Several proteins that regulate the morphology of the mitochondrial network have been identified, the most widely studied of which are Optic Atrophy 1 (OPA1), Mitofusin1 and 2 (Mfn1 and 2) and Dynamin Related Protein 1 (DRP1).
OPA1 is a ubiquitously expressed dynamin-like GTPase in the inner mitochondrial membrane. It plays important roles in mitochondrial fusion, apoptosis, reactive oxygen species (ROS) and ATP production. Mutations of OPA1 result in autosomal Dominant Optic Atrophy (DOA), a common hereditary optic neuropathy characterized by retinal ganglion cell degeneration leading to optic neuropathy, symmetrical central visual loss and dyschromatopsia. The majority of OPA1 mutations result in premature termination codons, and the resultant truncated mRNA species are highly unstable, being rapidly degraded by protective surveillance mechanisms operating via nonsense-mediated mRNA decay. Haploinsufficiency, therefore, is a major disease mechanism in DOA, and the pathological consequences of a dramatic reduction in OPA1 protein levels is highlighted by those rare families who are heterozygous for microdeletions spanning the entire OPA1 coding region. Progressive visual failure remains the defining feature of DOA but, with greater availability of genetic testing, a specific OPA1 mutation in exon 14 (c.1334G>A, p.Arg445His) has been found to cause sensorineural deafness, ataxia, myopathy, peripheral neuropathy, and classical chronic progressive external ophthalmoplegia. This syndrome is called DOA plus.
The molecular mechanisms linking OPA1 mutations and DOA are not fully understood. In this work a new model of OPA1-linked Dominant Optic Atrophy was generated in Drosophila melanogaster, in order to use it for studying DOA pathogenesis.
The Drosophila OPA1 gene (dOPA1) shares 51.2% similarity with its human orthologue and the alignment of protein sequence of hOPA1 with dOPA1 shows that the domains most subjected to pathogenic mutations are well conserved.
To address the pathophysiological mechanism of OPA1-linked DOA, we generated two dOPA1 mutants: OPA1 R417H, a mutant that carries in endogenous dOPA1 the mutation corresponding to R445H in humans; OPA1null carrying a microdeletion leading to production of a inactive truncated protein of 482 amino acids.
To model these mutations we have used in vivo CRISPR/Cas9, a genome engineering system that has revolutionized genetic analysis in many organisms. For use in genome engineering the system requires two essential components: gRNA and Cas9-endonuclease. The gRNA recognizes a 20-nt target sequence next to a trinucleotide NGG protospacer adjacent motif (PAM) to direct Cas9-dependent cleavage of both DNA strands within the target sequence. Several groups have used the CRISPR/Cas9 system to induce targeted mutations in Drosophila, but differ in their approach to supply the Cas9 protein and gRNA components of the system. It has been demonstrated that two targeting gRNAs can be used to generated a large defined deletions and the Cas9 catalyzed gene replacement by homologous recombination.
The experimental design of my work requires the following steps: generation of the gRNAs responsible for precisely targeting the genomic region where recombination should take place; generation of the dsDNA templates containing the desired genomic modifications to be introduced and homology arms for accurate recombination; choice of a screening method.
The gRNAs guide the cut of the Cas9 on the genomic region of the dOPA1 gene through the target sequences and the PAM sites; the cut of genomic DNA favors homologous recombination with the dOPA1 mutated fragment cloned into dsDNA plasmid donor. The exogenous dOPA1 mutated gene in addition to the pathological mutations carries a silent mutation that introduces a novel BamHI restriction site necessary for screening the occurrence of homologous recombination events by restriction digest.
The gRNAs and the dsDNA plasmids donors were microinjected in the embryo of the Drosophila line expressing Cas9 protein in the ovary under control of vasa regulatory sequences.
The mutants were screened for the presence of the mutation through PCR on genomic DNA, restriction digest and sequencing of the OPA1 mutated fragment. After having verified that the mutants had mutations of interest without any other alterations, we described the phenotypic effects observed in these mutants. We also analyzed the mitochondria in the nervous and muscular systems using confocal microscopy and the mitochondrial functions through biochemical assays.
Observations of the adults within the lines shows that both mutations in heterozygosity do not cause any evident morphological alterations. However, both mutations in homozygosity turned out to be lethal but differently R417H homozygous mutants develop until the second instar larva stage whereas the OPA1null homozygotes die earlier at the first instar larva stage.
We were more interested in studying the heterozygote dOPA1 mutants because DOA is a dominant disease. The lifespan reduction of both dOPA1 mutants indicate that the heterozygous mutations of OPA1 is likely to cause systemic consequences probably affecting multiple processes. Since OPA1 is involved in mitochondrial dynamics we performed a series of experiments to analyze mitochondrial morphology in the neuronal and muscular systems of both dOPA1 mutants. Heterozygous dOPA1 mutants display defects of mitochondria morphology in nerves and muscles in Drosophila third instar larvae, mitochondria network shape is characterized by mild fragmentation and clusterization. Mitochondria function was analyzed on homozygous and heterozygous dOPA1 mutants. Mitochondrial respiration and the redox activity of respiratory complexes was decreased in both mutants. Furthermore heterozygous OPA1 R417H displayed more severe effects in some assays than OPA1null heterozygotes. This suggested that R417H mutation could interfere with the activity of the wild type copy of dOPA1 resulting in more severe phenotypes than those caused by the presence of a single loss of function allele.
In conclusion, we have produced a model to study the Dominant Optic Atrophy which can be helpful to understand the pathogenesis of this disease caused by different classes of mutations within the OPA1 gene.

Abstract (italian)

I mitocondri sono organelli dinamici fondamentali per la vita e la morte delle cellule eucariotiche, svolgono diverse funzioni tra cui: produzione di ATP, regolazione dell’omeostasi del Ca2+, produzione di ROS e regolazione dell’apoptosi. I processi di fusione e fissione mitocondriale (dinamiche mitocondriali) sono alla base del corretto funzionamento di questi organelli e sono controllati da una serie di proteine che, di conseguenza, regolano forma e struttura dei mitocondri.
Disturbi delle dinamiche mitocondriali sono alla base di diverse patologie neurodegenerative che colpiscono bambini e giovani adulti. Le diverse proteine che regolano la morfologia della network mitocondriale sono state individuate in vari studi, le principali sono: Optic Atrophy 1 (OPA1), Mitofusin1 and 2 (Mfn1 and 2) and Dynamin Related Protein 1 (DRP1).
OPA1 è una proteina ubiquitaria della famiglia delle dianamine, con attività GTPasica, situata sulla membrana interna dei mitocondri. Presenta un ruolo fondamentale nel processo di fusione mitocondriale, apoptosi, produzione di ROS e produzione di ATP. Mutazioni di OPA1 sono alla base dell’ Atrofia Ottica Dominante (DOA), una comune neuropatia ottica ereditaria caratterizzata da degenerazione delle cellule ganglionari della retina con conseguente neuropatia, perdita della capacità visiva simmetrica centrale e discromatopsia. La maggior parte delle mutazioni patologiche di OPA1 determinano la formazione di codoni di stop, con conseguente produzione di forme troncate di mRNA altamente instabili che vengono rapidamente degradate dai vari meccanismi di controllo. L’aploinsufficienza è il principale meccanismo patogenetico della DOA, le conseguenze di una drastica riduzione dei livelli di OPA1 sono ben visibili in famiglie in cui sono state identificate microdelezioni in eterozigosi, localizzate nella regione codificante del gene di OPA1. La perdita progressiva della vista rimane la caratteristica principale della DOA ma, la maggior disponibilità di test genetici, ha permesso di identificare una mutazione specifica del gene OPA1 localizzata sull’esone 14 (c.1334G>A, p.Arg445His) che causa DOA, associa a sordità neurosensoriale, atassia, miopatia, neuropatia periferica e oftalmoplegia esterna progressiva cronica. Questa sindrome è chiamata DOA plus.
I meccanismi molecolari alla base di DOA causata da mutazioni di OPA1 non sono del tutto chiari. In questo lavoro abbiamo generato un nuovo modello di Atrofia Ottica Dominante usando Drosophila melanogaster, al fine di utilizzarlo per studiare e comprendere al meglio la patogenesi di questa malattia.
Il gene OPA1 di Drosophila (dOPA1) mostra il 51.2% di similarità con il gene ortologo umano, l’allineamento della proteina umana con quella di Drosophila mostra che i domini, su cui si localizzano la maggior parte delle mutazioni patologiche, sono altamente conservati.
Per studiare il meccanismo patofisiologico della DOA dovuta a mutazioni di OPA1, abbiamo generato due mutanti dOPA1: OPA1 R417H, un mutante che porta la mutazione corrispondente alla mutazione umana OPA1 R445H; e il mutante OPA1null in cui è stata inserita una microdelezione che determina la produzione di una forma tronca inattiva di 482 aminoacidi.
Per inserire queste mutazione nel genoma di Drosophila abbiamo utilizzato il sistema CRISPR/Cas9, un sistema che permette la modifica del DNA genomico e che ha rivoluzionato le analisi genetiche in diversi organismi. Le componenti fondamentali di questo sistema sono gRNA e endonucleasi Cas9. Il gRNA riconosce una sequenza target di 20nt seguita da un sito PAM (protospacer adjacent motif), costituito da tre nucleotidi NGG, e necessario per indirizzare il taglio dei due filamenti del DNA genomico ad opera dell’endonucleasi Cas9. Diversi gruppi di ricercatori hanno utilizzato il sistema CRISPR/Cas9 per introdurre specifiche mutazioni nel genoma di Drosophila, mettendo a punto vari metodi di somministrazione delle diverse componenti. È stato dimostrato che un approccio metodologico efficace, è l’utilizzo di una coppia di gRNA che, mediante il taglio del Ca9, determinano una larga delezione in una porzione genomica ben definita e questo, in presenza di una dsDNA donatore, favorisce la sostituzione genica mediante ricombinazione omologa.
Il disegno sperimentale del mio lavoro richiede i seguenti steps: generazione dei gRNA in grado di indirizzare il taglio dell’endonucleasi sulla regione genomica di interesse; generazione del dsDNA donatore contenete la porzione genica con le mutazioni desiderate e due regioni di omologia limitrofe ad essa e necessarie per la corretta ricombinazione e infine la scelta di un metodo di screening.
I gRNA guidano il taglio del Cas9 sulla porzione genomica del gene dOPA1 grazie alla sequenza target di 20nt e ai siti PAM; il taglio del DNA genomico favorisce la ricombinazione omologa con il frammento mutato di dOPA1 clonato nel plasmide dsDNA donatore. Sul frammento genico esogeno, oltre alla mutazione patologica di OPA1, è stata inserita una mutazione silente per introdurre un sito di restrizione dell’enzima BamHI, necessario per lo screening dei mutanti in cui è avvenuta la corretta ricombinazione.
I gRNAs e i plasmidi dsDNA donatori sono stati microiniettati in embrioni di una linea di Drosophila in cui la proteina Cas9 è espressa nelle cellule germinali, sotto il controllo del fattore di regolazione della trascrizione genica, vasa.
Lo screening per individuare i mutanti corretti è stato fatto mediante PCR sul DNA genomico, taglio di restrizione e sequenziamento. Dopo aver verificato la corretta ricombinazione omologa del frammento esogeno abbiamo eseguito una caratterizzazione fenotipica dei mutanti. Mediante microscopia confocale, abbiamo analizzato la morfologia dei mitocondri nel sistema nervoso e muscolare; con dei saggi biochimici abbiamo poi testato la funzionalità mitocondriale in larve mutanti.
Gli adulti eterozigoti per le mutazioni di dOPA1 non presentano evidenti alterazioni morfologiche. Entrambe le mutazioni però, risultano letali in omozigosi ma con delle differenze: la mutazione R417H risulta essere letale al secondo stadio larvale mentre la completa assenza di OPA1, che si determina nel mutante omozigote OPA1null, è letale al primo stadio larvale. Essendo DOA una malattia genetica dominante, è importante studiare gli effetti di queste mutazioni sui mutanti eterozigoti. Analizzando la durata media della vita dei mutanti adulti eterozigoti, abbiamo osservato un importante riduzione di questo parametro, simile per entrambe le mutazioni e collegato probabilmente agli effetti sistemici che si hanno in seguito all’alterazione di vari processi cellulari che coinvolgono OPA1 e i mitocondri. Dato che OPA1 è una proteina coinvolta nella regolazione delle dinamiche mitocondriali, abbiamo messo a punto una serie di esperimenti per analizzare la morfologia mitocondriale nel sistema nervoso e muscolare dei mutanti dOPA1. In larve terzo stadio eterozigoti per entrambe le mutazioni abbiamo osservato alterazioni della morfologia mitocondriale in nervi e muscoli, il network mitocondriale è caratterizzato da lieve frammentazione e presenza di cluster. La funzionalità mitocondriale è stata analizzata nei mutanti dOPA1 eterozigoti ed omozigoti. Respirazione mitocondriale e attività redox dei complessi della catena respiratoria risultano ridotte in entrambi i mutanti. Inoltre, il mutante OPA1 R417H eterozigote risulta avere deficit di funzionalità mitocondriale maggiore rispetto al mutante OPA1null eterozigote. Questo suggerisce che la mutazione R417H possa interferire con l’attività della copia wild type di dOPA1, determinando un fenotipo più grave della perdita di un solo allele funzionante.
Per concludere, possiamo affermare di aver prodotto un modello di Atrofia Ottica Dominate che potrebbe essere d’aiuto per lo studio della patogenesi di questa malattia e per comprendere meglio come agiscono le diverse classi di mutazioni sul gene OPA1

Statistiche Download - Aggiungi a RefWorks
EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Montopoli , Monica
Supervisor:Andrea, Daga
Ph.D. course:Ciclo 29 > Corsi 29 > SCIENZE FARMACOLOGICHE
Data di deposito della tesi:29 January 2017
Anno di Pubblicazione:29 January 2017
Key Words:Atrofia Ottica Dominante/Dominant Optic Atrophy, DOA, OPA1, Drosophila, Modello malattia/Model of Disease, sistema CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas9 system, mitocondri/Mitochondria, Malattie neurodegenerative/ Neurodegeneration Diseases
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/15 Biologia farmaceutica
Area 05 - Scienze biologiche > BIO/18 Genetica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze del Farmaco
Codice ID:10063
Depositato il:15 Nov 2017 10:11
Simple Metadata
Full Metadata
EndNote Format


I riferimenti della bibliografia possono essere cercati con Cerca la citazione di AIRE, copiando il titolo dell'articolo (o del libro) e la rivista (se presente) nei campi appositi di "Cerca la Citazione di AIRE".
Le url contenute in alcuni riferimenti sono raggiungibili cliccando sul link alla fine della citazione (Vai!) e tramite Google (Ricerca con Google). Il risultato dipende dalla formattazione della citazione.

1. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 872-884 (2010). Cerca con Google

2. Burté, F., Carelli, V., Chinnery, P. F. & Yu-Wai-Man, P. Disturbed mitochondrial dynamics and neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 11, 11-24 (2015). Cerca con Google

3. Nisoli, E. & Carruba, M. O. Nitric oxide and mitochondrial biogenesis. J. Cell. Sci. 119, 2855-2862 (2006). Cerca con Google

4. Hales, K. G. & Fuller, M. T. Developmentally Regulated Mitochondrial Fusion Mediated by a Conserved, Novel, Predicted GTPase. Cell 90, 121-129 (1997). Cerca con Google

5. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W. & Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. J. Cell Biol. 152, 683-692 (2001). Cerca con Google

6. Rojo, M., Legros, F., Chateau, D. & Lombès, A. Membrane topology and mitochondrial targeting of mitofusins, ubiquitous mammalian homologs of the transmembrane GTPase Fzo. J. Cell. Sci. 115, 1663-1674 (2002). Cerca con Google

7. Meeusen, S. et al. Mitochondrial Inner-Membrane Fusion and Crista Maintenance Requires the Dynamin-Related GTPase Mgm1. Cell 127, 383-395 (2006). Cerca con Google

8. McQuibban, G. A., Saurya, S. & Freeman, M. Mitochondrial membrane remodelling regulated by a conserved rhomboid protease. Nature 423, 537-541 (2003). Cerca con Google

9. Cipolat, S., De Brito, O. M., Dal Zilio, B. & Scorrano, L. OPA1 requires mitofusin 1 to promote mitochondrial fusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15927-15932 (2004). Cerca con Google

10. Yarosh, W. et al. The molecular mechanisms of OPA1-mediated optic atrophy in Drosophila model and prospects for antioxidant treatment. PLoS Genet. 4, 0062-0071 (2008). Cerca con Google

11. Koshiba, T. et al. Structural basis of mitochondrial tethering by mitofusin complexes. Science 305, 858-862 (2004). Cerca con Google

12. DeVay, R. M. et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. J. Cell Biol. 186, 793-803 (2009). Cerca con Google

13. Smirnova, E., Shurland, D. -., Ryazantsev, S. N. & Van Der Bliek, A. M. A human dynamin-related protein controls the distribution of mitochondria. J. Cell Biol. 143, 351-358 (1998). Cerca con Google

14. Mozdy, A. D., McCaffery, J. M. & Shaw, J. M. Dnm1p GTPase-mediated mitochondrial fission is a multi-step process requiring the novel integral membrane component Fis1p. J. Cell Biol. 151, 367-379 (2000). Cerca con Google

15. Zhang, Y. & Chan, D. C. Structural basis for recruitment of mitochondrial fission complexes by Fis1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18526-18530 (2007). Cerca con Google

16. Tieu, Q., Okreglak, V., Naylor, K. & Nunnari, J. The WD repeat protein, Mdv1p, functions as a molecular adaptor by interacting with Dnm1p and Fis1p during mitochondrial fission. J. Cell Biol. 158, 445-452 (2002). Cerca con Google

17. Lackner, L. L., Horner, J. S. & Nunnari, J. Mechanistic analysis of a dynamin effector. Science 325, 874-877 (2009). Cerca con Google

18. Ingerman, E. et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J. Cell Biol. 170, 1021-1027 (2005). Cerca con Google

19. James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y. & Martinou, J. -. hFis1, a novel component of the mammalian mitochondrial fission machinery. J. Biol. Chem. 278, 36373-36379 (2003). Cerca con Google

20. Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J. & McNiven, M. A. The mitochondrial protein hFis1 regulates mitochondrial fission in mammalian cells through an interaction with the dynamin-like protein DLP1. Mol. Cell. Biol. 23, 5409-5420 (2003). Cerca con Google

21. Lee, Y. -., Jeong, S. -., Karbowski, M., Smith, C. L. & Youle, R. J. Roles of the mammalian mitochondrial fission and fusion mediators Fis1, Drp1, Opa1 in apoptosis. Mol. Biol. Cell 15, 5001-5011 (2004). Cerca con Google

22. Breckenridge, D. G. et al. Caenorhabditis elegans drp-1 and fis-2 Regulate Distinct Cell-Death Execution Pathways Downstream of ced-3 and Independent of ced-9. Mol. Cell 31, 586-597 (2008). Cerca con Google

23. Gandre-Babbe, S. & Van Der Bliek, A. M. The novel tail-anchored membrane protein Mff controls mitochondrial and peroxisomal fission in mammalian cells. Mol. Biol. Cell 19, 2402-2412 (2008). Cerca con Google

24. Merz, S. & Westermann, B. Genome-wide deletion mutant analysis reveals genes required for respiratory growth, mitochondrial genome maintenance and mitochondrial protein synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 10 (2009). Cerca con Google

25. Chen, H., McCaffery, J. M. & Chan, D. C. Mitochondrial Fusion Protects against Neurodegeneration in the Cerebellum. Cell 130, 548-562 (2007). Cerca con Google

26. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y. & Sheng, M. The Importance of Dendritic Mitochondria in the Morphogenesis and Plasticity of Spines and Synapses. Cell 119, 873-887 (2004). Cerca con Google

27. Amchenkova, A. A., Bakeeva, L. E., Chentsov, Y. S., Skulachev, V. P. & Zorov, D. B. Coupling membranes as energy-transmitting cables. I. Filamentous mitochrondia in fibroblasts and mitochondrial clusters in cardiomyocytes. J. Cell Biol. 107, 481-495 (1988). Cerca con Google

28. Balaban, R. S., Nemoto, S. & Finkel, T. Mitochondria, Oxidants, and Aging. Cell 120, 483-495 (2005). Cerca con Google

29. Nakada, K. et al. Inter-mitochondrial complementation: Mitochondria-specific system preventing mice from expression of disease phenotypes by mutant mtDNA. Nat. Med. 7, 934-940 (2001). Cerca con Google

30. He, C. & Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009). Cerca con Google

31. Twig, G. et al. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008). Cerca con Google

32. Youle, R. J. & Karbowski, M. Mitochondrial fission in apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 657-663 (2005). Cerca con Google

33. Suen, D. -., Norris, K. L. & Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008). Cerca con Google

34. Fannjiang, Y. et al. Mitochondrial fission proteins regulate programmed cell death in yeast. Genes Dev. 18, 2785-2797 (2004). Cerca con Google

35. Goyal, G., Fell, B., Sarin, A., Youle, R. J. & Sriram, V. Role of Mitochondrial Remodeling in Programmed Cell Death in Drosophila melanogaster. Developmental Cell 12, 807-816 (2007). Cerca con Google

36. Jagasia, R., Grote, P., Westermann, B. & Conradt, B. DRP-1-mediated mitochondrial fragmentation during EGL-1-induced cell death in C. elegans. Nature 433, 754-760 (2005). Cerca con Google

37. Frank, S. et al. The Role of Dynamin-Related Protein 1, a Mediator of Mitochondrial Fission, in Apoptosis. Developmental Cell 1, 515-525 (2001). Cerca con Google

38. Poos, G. I. et al. Structure-activity studies with the selective rat toxicant norbormide. J. Med. Chem. 9, 537-540 (1966). Cerca con Google

39. Rennison, D. et al. Synthesis and activity studies of analogues of the rat selective toxicant norbormide. Bioorg. Med. Chem. 15, 2963-2974 (2007). Cerca con Google

40. Ricchelli, F. et al. Species-specific modulation of the mitochondrial permeability transition by norbormide. Biochim. Biophys. Acta 1708, 178-186 (2005). Cerca con Google

41. Zulian, A. et al. Assessing the molecular basis for rat-selective induction of the mitochondrial permeability transition by norbormide. Biochim. Biophys. Acta 1767, 980-988 (2007). Cerca con Google

42. Bernardi, P. et al. The mitochondrial permeability transition from in vitro artifact to disease target. FEBS J. 273, 2077-2099 (2006). Cerca con Google

43. Rasola, A. & Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis 12, 815-833 (2007). Cerca con Google

44. Pletjushkina, O. Y. et al. Effect of oxidative stress on dynamics of mitochondrial reticulum. Biochim. Biophys. Acta 1757, 518-524 (2006). Cerca con Google

45. Legros, F., Lombes, A., Frachon, P. & Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell 13, 4343-4354 (2002). Cerca con Google

46. De Vos, K. J., Allan, V. J., Grierson, A. J. & Sheetz, M. P. Mitochondrial function and actin regulate dynamin-related protein 1-dependent mitochondrial fission. Curr. Biol. 15, 678-683 (2005). Cerca con Google

47. Liot, G. et al. Complex II inhibition by 3-NP causes mitochondrial fragmentation and neuronal cell death via an NMDA- and ROS-dependent pathway. Cell Death Differ. 16, 899-909 (2009). Cerca con Google

48. Benard, G. et al. Mitochondrial bioenergetics and structural network organization. J. Cell. Sci. 120, 838-848 (2007). Cerca con Google

49. Sauvanet, C., Duvezin-Caubet, S., di Rago, J. P. & Rojo, M. Energetic requirements and bioenergetic modulation of mitochondrial morphology and dynamics. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 558-565 (2010). Cerca con Google

50. Rossignol, R. et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Res. 64, 985-993 (2004). Cerca con Google

51. Westermann, B. Bioenergetic role of mitochondrial fusion and fission. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1817, 1833-1838 (2012). Cerca con Google

52. Chen, H., Chomyn, A. & Chan, D. C. Disruption of fusion results in mitochondrial heterogeneity and dysfunction. J. Biol. Chem. 280, 26185-26192 (2005). Cerca con Google

53. Chen, H. et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. J. Cell Biol. 160, 189-200 (2003). Cerca con Google

54. Scheckhuber, C. Q. et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9, 99-105 (2007). Cerca con Google

55. Scheckhuber, C. Q., Wanger, R. A., Mignat, C. A. & Osiewacz, H. D. Unopposed mitochondrial fission leads to severe lifespan shortening. Cell. Cycle 10, 3105-3110 (2011). Cerca con Google

56. Sato, A., Nakada, K. & Hayashi, J. Mitochondrial dynamics and aging: Mitochondrial interaction preventing individuals from expression of respiratory deficiency caused by mutant mtDNA. Biochim. Biophys. Acta 1763, 473-481 (2006). Cerca con Google

57. Tondera, D. et al. SLP-2 is required for stress-induced mitochondrial hyperfusion. EMBO J. 28, 1589-1600 (2009). Cerca con Google

58. Twig, G., Hyde, B. & Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta 1777, 1092-1097 (2008). Cerca con Google

59. Yu-Wai-Man, P., Bailie, M., Atawan, A., Chinnery, P. F. & Griffiths, P. G. Pattern of retinal ganglion cell loss in dominant optic atrophy due to OPA1 mutations. Eye 25, 596-602 (2011). Cerca con Google

60. Yu-Wai-Man, P. et al. Genetic screening for OPA1 and OPA3 mutations in patients with suspected inherited optic neuropathies. Ophthalmology 118, 558-563 (2011). Cerca con Google

61. Alexander, C. et al. OPA1, encoding a dynamin-related GTPase, is mutated in autosomal dominant optic atrophy linked to chromosome 3q28. Nat. Genet. 26, 211-215 (2000). Cerca con Google

62. Beumer, K. J. et al. Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19821-19826 (2008). Cerca con Google

63. Wang, A., Fann, M., Yu, H. & Yen, M. OPA1 expression in the human retina and optic nerve. Exp. Eye Res. 83, 1171-1178 (2006). Cerca con Google

64. Yu-Wai-Man, P. et al. The Prevalence and Natural History of Dominant Optic Atrophy Due to OPA1 Mutations. Ophthalmology 117, 1538-1546.e1 (2010). Cerca con Google

65. Marchbank, N. J. et al. Deletion of the OPA1 gene in a dominant optic atrophy family: evidence that haploinsufficiency is the cause of disease. J. Med. Genet. 39 (2002). Cerca con Google

66. Amati-Bonneau, P. et al. OPA1 R445H mutation in optic atrophy associated with sensorineural deafness. Ann. Neurol. 58, 958-963 (2005). Cerca con Google

67. Leruez, S. et al. Sensorineural hearing loss in OPA1-linked disorders. Brain 136 (2013). Cerca con Google

68. Amati-Bonneau, P. et al. OPA1 mutations induce mitochondrial DNA instability and optic atrophy 'plus' phenotypes. Brain 131, 338-351 (2008). Cerca con Google

69. Yu-Wai-Man, P. et al. Multi-system neurological disease is common in patients with OPA1 mutations. Brain 133, 771-786 (2010). Cerca con Google

70. Liskova, P. et al. Novel OPA1 missense mutation in a family with optic atrophy and severe widespread neurological disorder. Acta Ophthalmol. 91, e225-e231 (2013). Cerca con Google

71. Frezza, C. et al. OPA1 Controls Apoptotic Cristae Remodeling Independently from Mitochondrial Fusion. Cell 126, 177-189 (2006). Cerca con Google

72. Jackson, G. R. Guide to understanding Drosophila models of neurodegenerative diseases. PloS Biol. 6, 0236-0239 (2008). Cerca con Google

73. Cauchi, R. J. & Van Den Heuvel, M. The fly as a model for neurodegenerative diseases: Is it worth the jump? Neurodegenerative Dis. 3, 338-356 (2006). Cerca con Google

74. Chan, H. Y. E. & Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000). Cerca con Google

75. Debattisti, V. & Scorrano, L. D. melanogaster, mitochondria and neurodegeneration: Small model organism, big discoveries. Mol. Cell. Neurosci. 55, 77-86 (2013). Cerca con Google

76. Dorn II, G. W. et al. MARF and Opa1 control mitochondrial and cardiac function in Drosophila. Circ. Res. 108, 12-17 (2011). Cerca con Google

77. Tang, S., Le, P. K., Tse, S., Wallace, D. C. & Huang, T. Heterozygous mutation of Opa1 in Drosophila shortens lifespan mediated through increased reactive oxygen species production. PLoS ONE 4 (2009). Cerca con Google

78. Shahrestani, P. et al. Heterozygous mutation of Drosophila Opa1 causes the development of multiple organ abnormalities in an age-dependent and organ-specific manner. PLoS ONE 4 (2009). Cerca con Google

79. Brachmann, C. B. & Cagan, R. L. Patterning the fly eye: the role of apoptosis. Trends in Genetics 19, 91-96 (2003). Cerca con Google

80. Bassett, A. R. & Liu, J. CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila. Journal of Genetics and Genomics 41, 7-19 (2014). Cerca con Google

81. Liu, J. et al. Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy. Journal of Genetics and Genomics 39, 209-215 (2012). Cerca con Google

82. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G. & Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics 161, 1169-1175 (2002). Cerca con Google

83. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K. & Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science 300, 764 (2003). Cerca con Google

84. Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M. & Nakatura, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isoenzyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J. Bacteriol. 169, 5429-5433 (1987). Cerca con Google

85. Jansen, R., Van Embden, J. D. A., Gaastra, W. & Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol. Microbiol. 43, 1565-1575 (2002). Cerca con Google

86. Barrangou, R. et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315, 1709-1712 (2007). Cerca con Google

87. Garneau, J. E. et al. The CRISPR/cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature 468, 67-71 (2010). Cerca con Google

88. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, E2579-E2586 (2012). Cerca con Google

89. Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012). Cerca con Google

90. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013). Cerca con Google

91. Wang, H. et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 153, 910-918 (2013). Cerca con Google

92. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P. & Liu, J. -. Mutagenesis and homologous recombination in Drosophila cell lines using CRISPR/Cas9. Biol. Open 3, 42-49 (2014). Cerca con Google

93. Yu, Z. et al. Highly efficient genome modifications mediated by CRISPR/Cas9 in Drosophila. Genetics 195, 289-291 (2013). Cerca con Google

94. Shan, Q. et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31, 686-688 (2013). Cerca con Google

95. Dicarlo, J. E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013). Cerca con Google

96. Gratz, S. J. et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics 194, 1029-1035 (2013). Cerca con Google

97. Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013). Cerca con Google

98. Esvelt, K. M. et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods 10, 1116-1123 (2013). Cerca con Google

99. Mojica, F. J. M., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J. & Almendros, C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology 155, 733-740 (2009). Cerca con Google

100. Bassett, A., Tibbit, C., Ponting, C. & Liu, J. Highly Efficient Targeted Mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 System. Cell Reports 4, 220-228 (2013). Cerca con Google

101. Gratz, S. J., Wildonger, J., Harrison, M. M. & O'Connor-Giles, K. M. CRISPR/Cas9-mediated genome engineering and the promise of designer flies on demand. Fly 7 (2013). Cerca con Google

102. Sebo, Z. L., Lee, H. B., Peng, Y. & Guo, Y. A simplified and efficient germline-specific CRISPR/Cas9 system for Drosophila genomic engineering. Fly 8 (2014). Cerca con Google

103. Kondo, S. & Ueda, R. Highly Improved gene targeting by germline-specific Cas9 expression in Drosophila. Genetics 195, 715-721 (2013). Cerca con Google

104. Ren, X. et al. Optimized gene editing technology for Drosophila melanogaster using germ line-specific Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 19012-19017 (2013). Cerca con Google

105. Smih, F., Rouet, P., Romanienko, P. J. & Jasin, M. Double-strand breaks at the target locus stimulate gene targeting in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 23, 5012-5019 (1995). Cerca con Google

106. Rong, Y. S. & Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science 288, 2013-2018 (2000). Cerca con Google

107. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K. & Carroll, D. Donor DNA utilization during gene targeting with zinc-finger nucleases. G3 Genes Genome Genet. 3, 657-664 (2013). Cerca con Google

108. Yang, H., Wang, H. & Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat. Protoc. 9, 1956-1968 (2014). Cerca con Google

109. Trounce, I. A., Kim, Y. L., Jun, A. S. & Wallace, D. C. [42] Assessment of mitochondrial oxidative phosphorylation in patient muscle biopsies, lymphoblasts, and transmitochondrial cell lines. Methods Enzymol. 264, 484-509 (1996). Cerca con Google

110. Hudson, G. et al. Mutation of OPA1 causes dominant optic atrophy with external ophthalmoplegia, ataxia, deafness and multiple mitochondrial DNA deletions: A novel disorder of mtDNA maintenance. Brain 131, 329-337 (2008). Cerca con Google

111. Zanna, C. et al. OPA1 mutations associated with dominant optic atrophy impair oxidative phosphorylation and mitochondrial fusion. Brain 131, 352-367 (2008). Cerca con Google

Download statistics

Solo per lo Staff dell Archivio: Modifica questo record