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Costiniti, Veronica (2017) Characterization of the activation of monoamine oxidases in conditions of cardiac damage and inflammation. [Ph.D. thesis]

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Thesis not accessible until 15 November 2019 for intellectual property related reasons.
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Abstract (english)

Mitochondria represent the main site of both ROS formation and degradation. One of the main source of mitochondrial ROS is represented by monoamine oxidases (MAOs). MAOs are flavoenzymes located in the outer mitochondrial membrane, which catalyse the oxidative deamination of biogenic amines yielding aldehydes, ammonia, and hydrogen peroxide (H2O2). It has been demonstrated that these products contribute to the oxidative stress occurring in hearts subjected to pathological conditions, such as cardiac reperfusion injury and decompensated hypertrophy. As MAO inhibitors significantly protect the heart in these models of cardiac injury, we focused our attention on the molecular mechanisms underlying MAO activation. To address this issue we investigated (i) the availability of MAO substrates under conditions of oxidative stress or injury and (ii) their main cellular sources in the whole heart. By mass spectrometry (MS) analysis we identified several amines that became available upon different ex vivo protocols of cardiac injury, and we focused our attention on N-tele-methylhistamine (NMH) and its precursor histamine, which were found the most abundant. Thus, we evaluated the contribution of myocyte and non-myocyte cells as possible sources of MAO substrates. For this purpose we firstly excluded synaptic terminals that innervate heart by mice injection of a neurotoxin, 6-hydroxydopamine (6-OH-DOPA). Our findings demonstrate the relevant contribution of synaptic terminals to increase the availability of MAO substrates in the ex vivo model of oxidative stress. Next we considered isolated cardiomyocytes, as these cells undergo MAO-dependent oxidative stress. We showed that cardiomyocytes can synthesize MAO substrates and to induce MAO activity when exposed to oxidative stress. Taken together, we establish for the first time a relevant interaction between histamine metabolism and MAO activity in cardiac injury, that does not involve a receptor-dependent pathway. These findings can explain how MAO activity is turned on when cells are stressed. Moreover, it also helps understanding how the increase in MAO activity amplifies an initial oxidative stress.
It has been largely shown that inflammation is usually involved in cardiac diseases and monocytes (Mn), macrophages (MF) as well as mast cells are involved in the inflammatory response. We focused our attention on immune phagocytic cells since the role of MAO has not been conclusively defined. Firstly, we demonstrated that both the MAO isoforms were expressed in both M1 and M2 MF. We focused our attention on MAO A, as it resulted the most expressed and significant isoform, especially in M2 MF. Then, we characterized its pathway of induction considering two different stimuli: LPS, that is a pro-inflammatory signal and IL-4 plus IL-13 (IL-4+IL-13), that is a combination of anti-inflammatory cytokines.
It is well known that during differentiation and polarization MF generate ROS, which leads to the activation of different signalling pathways. However, the mechanisms that induce ROS formation and activate this signalling remain unclear. Here we demonstrated that MAO contributes to macrophage differentiation and polarization through its H2O2 production.
Taken together, these data demonstrate for the first time that MAO-A plays a role in M2 MF differentiation and activation, besides its role in amine oxidative degradation. These novel insights about MAO activity in phagocytic cells suggest that this enzyme could represent a new target to modulate MF differentiation and activation under pathological conditions to avoid the side effects related to inflammation such as fibrosis, cardiac remodelling, and oxidative stress amplification in post-ischemic reperfusion injury.

Abstract (italian)

I mitocondri rappresentano il sito principale di origine e smaltimento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS). Una delle più importanti fonti mitocondriali di ROS è rappresentata dalle monoammino ossidasi (MAO). Le MAO sono flavoenzimi situati nella membrana mitocondriale esterna, che catalizzano la deaminazione ossidativa di ammine biogeniche, producendo aldeidi, ammoniaca e perossido d'idrogeno (H2O2). È stato dimostrato che questi prodotti contribuiscono allo stress ossidativo che si verifica in cuori soggetti a condizioni patologiche, come ad esempio l'ischemia riperfusione e lo scompenso da ipertrofia. Dato che gli inibitori per le MAO proteggono significativamente il cuore in questi modelli di danno cardiaco, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sui meccanismi molecolari alla base dell'attivazione di questi enzimi. A questo scopo è stata analizzata (i) la disponibilità dei substrati per le MAO in condizioni di stress ossidativo o danno cardiaco, e sono state valutate (ii) le principali fonti cellulari per questi substrati nel cuore. Mediante spettrometria di massa (MS) sono state identificate diverse ammine, rese disponibili in due differenti protocolli sperimentali d'induzione di stress cardiaco ex vivo.
Particolare attenzione è stata data alla N-tele-Metilistamina (NMH) ed il suo precursore istamina, che rappresentavano la maggiore frazione di ammine sul contenuto totale nel cuore in queste condizioni di stress. Quindi, è stato valutato il contributo delle cellule miocitiche e non, come possibili fonti di substrati per le MAO. Anzitutto sono stati considerati i terminali sinaptici che innervano il cuore, e quindi eliminati iniettando gli animali con una neurotossina, la 6-idrossidopamina (6-OH-DOPA). I risultati così ottenuti dimostrano il contributo dei terminali nell'aumentare la disponibilità di substrati per le MAO nel modello ex vivo sottoposto a stress ossidativo. Sucessivamente, abbiamo considerato i cardiomiociti isolati, in quanto anch'essi subiscono lo stress ossidativo dipendente dalle MAO. Infatti abbiamo dimostrato che i cardiomiociti soggetti a stress ossidativo sono in grado di sintetizzare substrati per le MAO, promuovendo l'attività dell'enzima. Si stabilisce così per la prima volta un'importante relazione tra il metabolismo dell'istamina e l'attività dell'enzima MAO in condizioni di danno cardiaco, la quale non comporta alcuna dipendenza da un eventuale recettore istaminergico. Questi risultati spiegano come lo stress cellulare possa indurre l'attività enzimatica dell'enzima MAO amplificando l'iniziale stress ossidativo.
È stato ampiamente dimostrato che l'infiammazione insorge durante le malattie cardiache e non solo, inoltre che le cellule infiammatorie coinvolte come monociti (Mn), macrofagi (MF) e mastociti sono particolarmente rilevanti ed attive. Pertanto la nostra attenzione è stata incentrata dalle cellule fagocitarie in cui il ruolo dell'enzima MAO non è stato ancora definito. In primo luogo, è stato dimostrato che entrambe le isoforme MAO (A e B) sono espresse sia nei MF M1 che M2. Poi ci siamo focalizzati su MAO A, in quanto è risultata essere l'isoforma principalmente espressa, soprattutto nei MF M2. In seguito è stato caratterizzato il suo meccanismo d'induzione, considerando due diversi stimoli: l'LPS e la combinazione delle citochine anti-infiammatorie IL-4 ed IL-13 (IL-4 + IL-13).
È noto che, durante i processi di differenziamento e di polarizzazione, i MF generino ROS, che inducono l'attivazione di diverse vie di segnale. Tuttavia, i meccanismi che inducono la formazione di questi ROS non sono stati caratterizzati.
In questo lavoro è stato dimostrato per la prima volta che l'isoforma A dell'enzima MAO svolge un ruolo rilevante nel differenziamento e nell'attivazione dei MF M2, mediante la produzione di H2O2. Questi nuovi risultati nelle cellule fagocitiche suggeriscono che questo enzima potrebbe rappresentare un nuovo bersaglio per modulare il differenziamento e l'attivazione dei MF. In particolare, in condizioni patologiche la loro modulazione potrebbe limitare gli effetti collaterali legati all'infiammazione, come ad esempio la fibrosi, il rimodellamento cardiaco, e l'amplificazione dello stress ossidativo nel danno da ischemia/riperfusione.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Canton, Marcella
Supervisor:Di Lisa, Fabio
Ph.D. course:Ciclo 29 > Corsi 29 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:30 January 2017
Anno di Pubblicazione:30 January 2017
Key Words:monoamino ossidasi, macrofagi, cardiomiocita
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/10 Biochimica
Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Centri > Centro Interdipartimentale di servizi A. Vallisneri
Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Biomediche
Codice ID:10108
Depositato il:16 Nov 2017 09:54
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