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Donati, Maddalena (2017) Effects of plant-derived polyphenols on glycation and oxidative stress related to vascular diseases. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

There is a large amount of evidence indicating that oxidative stress and glycation play a crucial role in aging as well as in neurodegenerative and cardiovascular diseases. Oxidative stress is linked with reactive oxygen species (ROS), whose harmful effects can lead to several pathological conditions like vascular alterations, diabetes complications and inflammation. Moreover, ROS and oxidative stress can directly contribute to glycation reactions with the formation of reactive α-oxoaldehydes and advanced glycation end-products (AGEs). The glycation process is characterized by non-enzymatic reactions between aldehyde or keto groups of sugars and free amino-residues of proteins, which lead to the formation of AGEs. Glycation and AGEs cause the irreversible modification of the proteins structure and the consequent loss of their functionality, causing detrimental effect in vasculature. Thus, it can be reasonable that compounds which counteract the effect of oxidative stress and glycation may assume an important role in the prevention of vascular damage. Natural phenolic compounds and flavonoids have received attention for their biological effects, such as antioxidant and antiglycative activities. Despite the health claims of polyphenols, it is known that their bioavailability can vary dramatically depending on many factors. The effects of the polyphenols, and of their in vivo circulating metabolites, will ultimately depend on the extent to which they associate with cells, either by interactions at the membrane or more importantly by their cellular uptake. Therefore, in order to assess the potential activity of natural polyphenols, it is primarily important to evaluate the intestinal permeability and bioavailability. In this research, human colorectal carcinoma cells (HT-29) were used as experimental model of intestinal cells, to evaluate the polyphenols ability to cross the cellular membrane and permeate into the cell. The polyphenols studied in this research are characteristic phytoconstituents of several medicinal plants widely used in traditional medicine such as: baicalein (from Scutellaria baicalensis G.), eupatorin (Eupatorium semiserratum DC.), galangin (Alpinia officinarum L.), magnolol (Magnolia officinalis L.), myricetin (Myrica rubra S. Z.), oleuropein (Olea europaea L.), and silybin (Silybum marianum L.).
The aims of the PhD project were firstly to evaluate the HT-29 intestinal cells permeability of natural compounds, and secondly, to investigate the in vitro antiglycation activity of polyphenols and their activity against endothelial cellular damage related to oxidation and glycation, using HUVEC cells as experimental model for endothelium function. The results showed that the ability of polyphenols to cross the HT-29 cell membrane depends on many factors, including molecular size and hydrophilic properties of each compound. The flavonoids baicalein, eupatorin and galangin were able to cross the HT-29 cell membranes and undergo biotransformation process; conversely, oleuropein seemed to not been taken up in the HT-29 cells. The results of AGEs determination showed that most of the polyphenols, at the higher concentration, displayed antiglycative activity in all experimental conditions, and that baicalein, eupatorin and galangin showed the highest activity in counteract the AGEs formation.
In the experimental model involving HUVEC, the aim was to evaluate the potential role of several compounds related to hyperglycemia and glycation, such as glycated albumin, glyoxal and glucose at high concentration, in inducing cytotoxicity and oxidative stress. Moreover, the antioxidant activity of the selected natural compounds against the oxidative stress induced by those factors was assessed using the DCFH-DA assay. The results from ROS detection assay showed that the glycation products known as glycated albumin and glyoxal were not able to directly induce oxidative stress in HUVEC in the assay conditions, whereas glucose at high concentration displayed an effect of oxidative stress induction. Therefore, high glucose was used as oxidative stressor in the polyphenols evaluation assay. Baicalein, eupatorin and galangin were selected as natural compounds with a potential antioxidant activity, and their activity on ROS formation in HUVEC induced by high glucose was evaluated. The highest antioxidant activity was seen after the pre-treatment with the polyphenols at the concentration of 5 μM.
All together, the results obtained motivate further researches on the activities of polyphenols against oxidative and glycative damages in order to understand their potential role in the prevention of vascular diseases.

Abstract (italian)

Evidenze sperimentali indicano che lo stress ossidativo e la glicazione svolgono un ruolo cruciale nelle patologie neurodegenerative e cardiovascolari. Lo stress ossidativo è correlato alla formazione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), i cui effetti nocivi possono portare a diverse condizioni patologiche, quali le alterazioni vascolari, complicanze del diabete e stati infiammatori. Inoltre, i ROS e lo stress ossidativo possono contribuire direttamente al processo di glicazione tramite la formazione di aldeidi reattive (gliossale, metil-gliossale) e di prodotti finali della glicazione avanzata (AGEs). Il processo di glicazione è caratterizzato da una reazione non enzimatica tra un gruppo aldeidico di uno zucchero e un gruppo amminico libero di una proteina. La glicazione e la conseguente formazione di AGEs causano la modifica irreversibile della struttura delle proteine, e la conseguente perdita della loro funzionalità, provocando effetti negativi in ambito vascolare. Dunque, risulta evidente che composti in grado di contrastare lo stress ossidativo e la glicazione possano assumere un ruolo determinante nella prevenzione del danno vascolare. Composti naturali come fenoli e flavonoidi suscitano interesse per i loro potenziali effetti biologici, come l’attività antiossidante e antiglicativa. Nonostante le indicazioni di questi effetti, è noto che la biodisponibilità dei composti naturali può variare notevolmente a seconda di molti fattori. Gli effetti dei polifenoli e dei loro metaboliti che raggiungono la circolazione in vivo dipendono dalla loro interazione con le cellule, sia a livello della membrana cellulare o ancor più per il loro assorbimento. Pertanto, al fine di valutare la potenziale attività di polifenoli naturali, è soprattutto importante valutare la permeabilità intestinale e biodisponibilità. In questa ricerca, sono state utilizzate le cellule di carcinoma colorettale umano (HT-29) come modello sperimentale di cellule intestinali, per valutare la capacità dei polifenoli di attraversare la membrana cellulare e permeare all’interno delle cellule. I polifenoli studiati in questa ricerca sono fitocostituenti caratteristici di diverse piante medicinali ampiamente utilizzate nella medicina tradizionale: baicalein (da Scutellaria baicalensis G.), eupatorin (Eupatorium semiserratum DC.), Galangina (Alpinia officinarum L.), magnolol (Magnolia officinalis L.), myricetin (Myrica rubra SZ), oleuropeina (Olea europaea L.), e silibina (Silybum marianum L.).
Gli obiettivi del progetto di dottorato sono stati in primo luogo la valutazione della permeabilità dei composti naturali nelle cellule intestinali HT-29, e in secondo luogo, lo studio dell'attività antiglicativa in vitro dei polifenoli e la loro attività nei confronti del danno cellulare indotto dallo stress ossidativo e dalla glicazione nelle cellule endoteliali, utilizzando cellule HUVEC come modello sperimentale. I risultati hanno mostrato che la capacità dei polifenoli di attraversare la membrana delle cellule HT-29 dipende da molti fattori, tra cui la dimensione molecolare e le proprietà idrofile di ciascun composto.
I flavonoidi baicaleina, eupatorina e galangina sono stati in grado di attraversare le membrane cellulari HT-29 e sono andati incontro a processi di biotrasformazione. Al contrario, oleuropeina non ha mostrato permeabilità nelle cellule HT-29. I risultati riguardo la determinazione degli AGEs hanno mostrato che la maggior parte dei polifenoli, alla concentrazione più elevata sperimentata, ha mostrato attività antiglicativa in tutte le condizioni sperimentali, e che per baicaleina, eupatorina e galangina è stata riscontrata la più alta attività nel contrastare la formazione degli AGEs. Nel modello sperimentale che ha coinvolto le cellule HUVEC, l'obiettivo è stato quello di valutare il ruolo potenziale di diversi composti correlati all'iperglicemia e alla glicazione, come albumina glicata, gliossale e glucosio ad alte concentrazioni, nell’indurre citotossicità e stress ossidativo. Inoltre, è stata valutata l'attività antiossidante dei polifenoli naturali contro lo stress ossidativo indotto da tali composti, usando il saggio DCFH-DA. I risultati hanno mostrato che l’albumina glicata e gliossale non sono stati in grado di indurre direttamente stress ossidativo nelle HUVEC alle condizioni del saggio, mentre il glucosio ad alte concentrazioni ha determinato un effetto di induzione di stress ossidativo. Pertanto, il glucosio è stato utilizzato come ossidativo stress nel test di valutazione con i polifenoli. Baicaleina, eupatorina e galangina sono stati selezionati come composti naturali con potenziale attività antiossidante, ed è stata valutata la loro attività sulla formazione dei ROS nelle cellule HUVEC indotta dal glucosio. L'attività antiossidante più elevata è stata osservata dopo pre-trattamento con i polifenoli alla concentrazione di 5 μM. In conclusione, i risultati ottenuti incoraggiano ulteriori ricerche sulle attività dei polifenoli contro lo stress ossidativo e la glicazione, al fine di comprendere il loro ruolo potenziale nella prevenzione delle malattie vascolari.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Froldi, Guglielmina
Ph.D. course:Ciclo 29 > Corsi 29 > SCIENZE FARMACOLOGICHE
Data di deposito della tesi:31 January 2017
Anno di Pubblicazione:31 January 2017
Key Words:Polyphenols Natural compound Oxidative stress Glycation AGEs Vascular disease Diabetes Antioxidant activity
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/14 Farmacologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze del Farmaco
Codice ID:10274
Depositato il:03 Nov 2017 09:17
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