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Luengo Alonso, Claudia (2017) Novel formulations for Amphotericin B Delivery. [Ph.D. thesis]

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PDF Document (Novel formulations for amphotericin B delivery) - Accepted Version

Abstract (english)


Amphotericin B (AmB), a macrolide antibiotic with broad spectra of action, has been widely used in the treatment of systemic fungal infections since more than 40 years. Even though several new antifungal drugs have been developed, AmB remains the drug of choice in the treatment of severe systemic fungal diseases and in the treatment of visceral leishmaniasis when the parasite develops resistance to antimonial compounds.
The poor AmB solubility is the main drawback for the development of pharmaceutical formulations. So far, many attempts have been made to develop AmB formulations with enhanced therapeutic profiles, including solid-lipid nanoparticles, polymeric nanoparticles, liposomes, micelles and polymer bioconjugates.
Even though the amphotericin B associated nephrotoxicity is the main drawback for the use of this molecule in clinic, the fact that this antibiotic is only available for intravenous administration also limits its prescription. The development of AmB oral, intravenous and/or topical formulations with decreased toxicity will allow not only for the treatment of systemic fungal infections but also for the treatment of topical mixed-infections resistant to conventional treatments. These formulations will improve patient compliance and reduce the sanitary cost of the treatment.
Taking into account the rising importance and clinical repercussion of the mold infections in humans and animals, the development of new formulations that reinforce the current therapeutic arsenal is needed.
The wide spectra of action of amphotericin B together with its low appearance of resistance, makes this drug a suitable candidate for the treatment of different types of mycosis. Thus, the main objective of the present thesis will be focused on the development of new amphotericin B (AmB) formulations for the treatment of systemic and topical mycosis with reduced side effects.
Two AmB formulations will be developed. The first part of this project will be focused on the development of a new AmB topical formulation; a nail lacquer formulation for the treatment of mixed onychomycosis resistant to conventional treatments.
The second part of the thesis will be performed in collaboration with the University Degli Studi di Padova and it will be focused on the development and optimization of an AmB pegylated formulation for the treatment of systemic fungal infections by oral and intravenous administration. The AmB interactions with cholesterol-type molecules are known to favor the drug solubility. Thus, the conjugation of cholesterol-type molecules with different PEGs will allow for the encapsulation and solubilization of AmB. To achieve this general purpose some specific objectives are proposed which included the synthesis of different AmB pegylated complexes; the solubility studies in different conditions; the complexes characterization by DLS, HPLC, DSC, RX, FTIR, CD, ITC and synchrotron analysis; the ex vivo characterization of these complexes (toxicity by hemolysis and antifungal efficacy against Candida albicans) and finally, the in vivo pharmacokinetic studies after oral and intravenous administration. The pharmacokinetic properties of the new AmB formulation will be determined and compared to the commercialized formulations Ambisome® and Fungizone®.
With regards to the AmB topical formulation, different water permeable and impermeable nail lacquer formulations were prepared. The drying time, viscosity, aspect of the film, extensibility, brightness, AmB incorporation and pH were studied. From all the formulations developed, three of them were selected for further characterization and in vitro studies (F11, F13 and F19). Even though formulations 11, 13 and 19 overcame the AmB low solubility problems, the short-term stability of these formulations (1 month) was still a problem. The strategy used to overcome the short AmB stability was focused on obtaining powders for reconstitution. The freeze drying (for F11 and F13) and spray drying (for F19) generated stable lyophilized and spray dried products easily redispersable. In vitro nail penetration studies on female human nails, demonstrated the higher nail penetration reached with F19 (EF=1.95) compared to F11, F13 and to the control. The in vitro efficacy studies against Candida albicans showed that the most active formulation was F19 (103%). The AmB nail lacquer was active against the dermatophyte and non-dermatophyte infections located on keratinized structures. Treatment (30 days) with F19, administered in alternate days, once daily, cleared up the infections caused by T. mentagrophytes, T. rubrum, A. niger, F.oxysporum and F.solani. After 30 days of treatment no microorganisms were found nor in the culture media neither in the direct examination.
As far as the AmB pegylated formulation is concerned, the solubility studies showed that PEG5kDa-cholane can increase more than 105 times the AmB solubility according to a linear [dissolved drug]/ [polymer concentration] correlation. The different capability of PEG5kDa-cholane to solubilize AmB observed was explained by the effect of the dissolution conditions in the formation of monomeric and multimeric soluble species. The high affinity of AmB for PEG5kDa-cholane was observed by isothermal calorimetry (ITC). This technique highlighted the complexity of the PEG5kDa-cholane interaction with AmB, which takes place with different AmB soluble species, namely monomers, dimers, tetramers, and other multimeric nanoaggregates, of which abundance depends on the pH. The three different binding sites calculated by ITC analyses reasonably result from the PEG5kDa-cholane interaction with different AmB species through hydrophobic interactions between the cholane moiety and the heptaene side of the drug molecule to form different supramolecular structures. The lyophilization process produced a fluffy powder with low moisture content and without cake formation which was stable throughout the time. The CD studies showed that, similarly to Fungizone® and heated Fungizone®, AmB/PEG5kDa-cholane micelles did not induce structural alterations of human serum albumin (HSA). The hemolysis studies confirmed that the AmB/PEG5kDa-cholane micelles were less hemolytic than Fungizone®. Even at concentrations in which the Fungizone® caused 100% hemolysis, the new formulation produced not more than 30% hemolysis. The biological in vitro studies showed that the AmB formulated with PEG5kDa-cholane maintains high antimicrobial activity, which is very close to AmB in solution. The oral administration of 5 mg/kg AmB demonstrated that the new formulation developed had the highest half-life of all assayed formulations.
Finally, The IV administration of 1 mg/kg AmB in Ambisome®, Fungizone® and AmB/PEG5kDa-cholane showed that the new formulation developed had a significantly (P<0.01) lower apparent elimination constant and consequently, a higher half-life compared to the marketed formulations Ambisome® and Fungizone®.

This thesis includes the development of two different types of amphotericin B formulations: one topical formulation for the treatment of nail infections (conclusions 1-3) and one intravenous/oral formulation for the treatment systemic fungal infections. (Conclusions 4-12).
1.- A new water-impermeable stable nail lacquer formulation containing amphotericin B has been designed for the treatment of onychomycosis. The polymer (Eudragit L100®) and the amphotericin B solvent used (N-methyl-2-pyrrolidone) showed no compatibility problems. Once applied over a surface, the nail lacquer formed a continuous, homogenous and smooth film resistant to water.
2.- In vitro nail penetration studies showed that the lacquer was able to penetrate the nail (enhancement factor almost twice than the control). In vitro activity studies demonstrated the efficacy of the nail lacquer against dermatophyte and non-dermatophyte molds as well as yeasts (gender Candida).
3.- In vivo efficacy studies on keratinized structures of animal origin supported the efficacy of amphotericin B. After 30 days treatment on alternate days, the nail lacquer was able to clear up the infections caused by Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Aspergillus niger, Fusarium. oxysporum and Fusarium solani.
4.- A novel formulation for amphotericin B delivery has been developed by using a micelle forming 5 kDa monomethoxy-polyethylene glycol end functionalized with cholanic acid (PEG5kDa-cholane). This polymer was found to increase 105 times the amphotericin B solubility with a 12:1 AmB/PEG5kDa-cholane molar ratio (2:1 w/w ratio).
5.- The system AmB/PEG5kDa-cholane forms 30 nm micelles with the hydrophobic cholane moieties localized inside the micelles. Zeta potential analysis showed that at neutral pHs (5.5-7.2) the overall micelle surface is nearly neutral. The PEG5kDa-cholane interacts with amphotericin B according to three binding sites depending on the pH, suggesting that the polymer interaction depends on the amphotericin B ionization and aggregation.
6.- Once lyophilized, the freeze-dried product could be promptly redispersed to form an homogeneous colloidal dispersion. The dispersion was physicochemically stable. Fourier Transform infrared spectrometry, differential scanning calorimetry and X-ray diffractometry showed that in the lyophilized product, amphotericin B and PEG5kDa-cholane interacts intimately.
7.- The amphotericin B release from the PEG5kDa-cholane micelles showed a biphasic profile. The best fittings were obtained with the Higuchi and Korsmeyer-Peppas models.
8.- The toxicity of the new formulation was tested as hemolysis. The new AmB/PEG5kDa-cholane nanoformulation was always less hemolytic than the reference marketed formulation Fungizone®.
9.- The amphotericin B antifungal activity assayed against Candida albicans showed that AmB/PEG5kDa-cholane was 15% more active than the free amphotericin B in buffer.
10.- The IV pharmacokinetics profiles of the different formulations studied (Ambisome®, Fungizone® and AmB/PEG5kDa-cholane) were significantly different. The apparent elimination constant (Ke) of the new formulation is significantly (P<0.01) lower than both Ambisome® and Fungizone®. Accordingly, the half-life value of this new formulation was found to be higher. The IV administration of 1 mg/kg AmB/PEG5kDa-cholane caused less pain effect in the mice than the administration of the same dose of Fungizone® or Ambisome®.
11.- Oral pharmacokinetic studies confirmed that this new formulation has a higher half-life than Ambisome® and Fungizone® marketed formulations. The AUC0-24 values were similar for all tested formulations.
12.- It can be concluded that the new AmB/PEG5kDa-cholane formulation is a promising soluble controlled delivery system for amphotericin B with lower toxicity than the reference marketed formulation Fungizone®.

Abstract (italian)


L’amphotericina B (AmB) è un antibiotico macrolide con un ampio spettro d’azione, da oltre 40 anni usato nel trattamento di infezioni micotiche sistemiche.
Sebbene recentemente siano stati sviluppati nuovi farmaci antifungni, AmB rimane il farmaco di prima scelta nel trattamento di gravi infezioni fungine e nel trattamento di leismaniasi viscerale nel caso in cui i parassiti sviluppino una resistenza ai composti antimoniali.
La bassa solubilità di AmB è il principale problema al suo sviluppo farmaceutico e ad oggi si sono fatti numerosi tentativi per sviluppare formulazioni di AmB con migliorate caratterisitiche biofarmaceutiche e profilo terapeutico. Tra le principali formulazioni vi sono nanoparticlelle lipidiche solide, nanoparticelle polimeriche, micelle e bioconiugati polimerici
La nefrotossicità è uno dei maggiori problemi all’uso clinico di questo farmaco che si unisce alla difficoltà della somministrazione intravenosa.
Lo sviluppo di formualzioni per uso orale, intravenoso e topico con ridotta tossicità consente l’impiego di AmB nel trattamento di infezioni fungine sistemiche e topiche nel caso di infezioni miste resistenti oltre che nei tratatmenti tradizionali. Pertanto formulazioni innovative consentono un uso più razionale, sicuro e ampio di questo farmaco con una migliore performance terapeutica e compliance del paziente.
La crescente importanza delle ripercussioni cliniche delle infezioni nell’uomo e nell’animale ha portato alla necessità di sviluppare formulazioni che possano essere sempre più efficacy nel trattamento di quetse patologie e in grado di coprire in modo ampio lo sviluppo di infesioni.
L’ampio spettro di azione di amfotericina B (AmB) unitamente alla bassa resitenza sviluppata, rendono questo farmaco un eccellente candidato per il trattamento di vari tipi di micosi. Pertanto, il principale obiettivo di questo lavoro di tesi è stato lo sviluppo di nuove formulazioni di AmB per il tratatmento topico e sistemico di micosi con ridotta tossicità. Sono state sviluppate due tipi di formulazioni.
Nella prima parte del lavoro di tesi lo studio si è focalizzato su formulazioni per uso topico. In particolare, si è sviluppato uno smalto per unghie contenente AmB per il tratatmento di onicomicosi miste resistenti ai tarttamenti tradizionali.
Nella seconda parte del lavoro di tesi sono stati condotti studi formulativi di AmB in collaborazione con l’Università degli Studi di Padova. In quetso caso si è sviluppata una formualzione di AmB fisicamente PEGilata per il trattamento sistemico di infezioni fungine dopo somministarzione orale o intravenosa. In questo caso si è considerato che AmB è nota interagire con molecole di colesterolo e in generale stereoidee che ne favorisono la sua solubilità. Pertanto, si sono prodotti bioconiugati di moelcole steroidee con PEG in grado di aumentare la solubilità e stabilità di AmB. Si sono quindi preparati bioconiugati PEG-cholane e si sono ottenuti diversi tipi di assemblati AmB/PEG-cholane che sono stati caratterizzati attarverso varie tecniche tra cui: DLS, HPLC, DSC, RX, FTIR, CD, ITC e analisi con sicrotrone. Negli studi ex vivo di questi complessi si è studiata la tossicità mediante test di emolisi e l’efficacia antifungina contro Candida albicans. Infine, sono stati condotti alcuni studi in vivo dopo somministrazione orale e intarvenosa a topi. Le proprietà farmacocinetiche delle formualzioni di AmB sono state esaminate comapartvamente rispetto al farmaco in soluzione libera e a prodotti commerciali quali Ambisome® and Fungizone®.
Per quanto riguarda le formulazioni di AmB per uso topico, sono state preparate diverse formulazioni di smalto per le unghie sia permeabili che impermabili. Per queste preparazioni sono stati studiati il tempo sdi essiccamento, la visocsità, l’spetto del film, la stesura in film, la brillantezza, il pH e la capacià di incorporamento di AmB. Tra i vari prototipi formulativi preprati, ne sono stati slezionati tre che sono stati oggetto di ulteriori studi in vitro (F11, F13 and F19). Sebbene le formulazioni 11, 13 e 19 consentissero di superare i problemi di bassa solubilità di AmB, la stabilità nel breve periodo (1 mese) ha rappresentato ancora un grande limite al loro impiego. La strategia impiegata per superare i problemi d stabilità di AmB ha portato a considerare in particolare lo sviluppo di polveri da ricostituire estemporaneamente. Le tecniche di freeze drying (nel caso di F11 e F13) e spray drying (nel caso di F19) hanno generato prodotti essiccati e liofilizzati stabili e facilmente risispersibili. Studi di penettrazione unghieale in vitro condotti su unghie femminili umane, hanno dimostrato una maggiore penetrazione nel caso di F19 (EF=1.95) rispetto a F11, F13 e al controllo. Gli studi in vitro condotti con Candida albicans ha dimostrato che la formualzione più efficace era F19 (103%). Lo smalto per unghie contenente AmB è risultato efficace nel tratatmento di infzsione dermatofitiche e non-dermatofitiche non localizzate nelle strutture cheratinizzate. Il trattamento per 30 giorni con F19, somministarto una volta al giorno a giorni alternati, ha portato all’eliminazione dell’infezione di T. mentagrophytes, T. rubrum, A. niger, F.oxysporum and F.solani. Dopo 30 giorni di trattamento non si è rilevato alcun microorganizmo né per esame diretto né con studi con culture cellulari.
Per quanto riguarda le formulazioni PEGilate di AmB, gli studi di solubilità hanno dimostrato che il PEG5kDa-cholane può aumentare fino a 105 volte la solubilità di AmB con una correlazione lineare [farmaco sciolto]/[polimero]. La diversa capacità del PEG5kDa-cholane di solubilizzare AmB è stata ascritta alle diverse forme fisiche, monmeriche, multimeriche e aggregate del farmaco. Mediante calorimetria isotermica (ITC) è stata osservata una elevata affinità di AmB per PEG5kDa-cholane. Questa tecnica ha evidenziato la complessità delle inetrazioni tra il farmaco e il polimero che avvengono con diverse forme di AmB, monomeri e multimeri, inclusi nanoaggergati solubili la cui composizione e abbndanza dipende dal pH. I tre diversi siti di binding calcolati mediante ITC risultano ragionevolemente dalle interazioni di varie zone idrofobiche eptaeniche di AmB con la frazione dell’acido colanico. Il processo di liofilizzazione ha prodotto una polvere soffice con basso contenuto di umidità senza formazione di un cake. Questo prodotto è risultato stabile nel lungo periodo. L’analisi spettoemtrica CD ha mostrato che come nel caso di Fungizone® e Fungizone® riscaldato, le micelle di AmB/PEG5kDa-cholane non inuucono alterazioni struttirali di albumina (HSA). Gli studi di emolisi hanno confermato che le micelle di AmB/PEG5kDa-cholane sono meno emolitiche di Fungizone®. Anche nel caso in cui Fungizone® induce il 100% di emolisi, la formulazione AmB/PEG-cholane non provoca più del 30% di emolisi. Gli studi di attività biologica hanno mostrato che AmB formulate con PEG5kDa-cholane mantiene una elevata attività antifungina, che è risultata essere molto simile a quella di AmB in soluzione libera. La somministarzione orale di 5 mg/kg di AmB ha mostrato una maggiore emivita plasmatica del farmaco rispetto ad alter formulazioni. Infine, la somministarzione intravenosa di 1 mg/kg di AmB in Ambisome®, Fungizone® e AmB/PEG5kDa-cholane ha mostrato che la nuova formulazione ha una significativamente (P<0.01) minore costante di eliminazione apparente e una maggiore emivita plasmatica rispetto alle formualzioni commerciali Ambisome® and Fungizone®.
In questo lavoro di tesi vengono riportate le preparazioni di due tipi di formulazioni di AmB, una per uso topico per il trattamento di infezioni fungine unghieali (conclusione 1-3) e una formulazione per la somministrazione intarvenosa o orale per il trattamento di infesioni sistemiche (conclusione 4-12).
1.- Un nuovo smalto per unghie impermeabile conetenente AmB è stato prodotto per il trattamento di onicomicosi. Il polimero (Eudragit L100®) e AmB non hanno dimostarto incompatibilità con il solvente (N-methyl-2-pyrrolidone). Una volta applicato sulla superficie lo smalto forma uno strato omogeneo, continuo, liscio e resistente all’acqua.
2.- Studi in vitro hanno dimostrato che lo smalto può penetrare le unghie con un incremento di quasi 2 volte rispetto al controllo. Studi di attività in vitro hanno dimostarto l’efficacia dello smalto per unghie nel trattamento di dermatofiti e non dermatofiti quali muffe (tipo Candida).
3.- Gli studi di efficacia in vivo condotti su cheratina di origine animale hanno dimostrato l’efficacia di AmB. Dopo un tratatmento di 30 giorni a giorni alternati, lo smalto per unghie ha eliminato le infezioni da Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Aspergillus niger, Fusarium. oxysporum e Fusarium solani.
4.- E’ stata sviluppata una nuova formualzione di AmB usando micelle costituite da un bioconiugato di 5 kDa monometossi polietilene glicole funzioanlizzato ad un terminale con acido colanico (PEG5kDa-cholane). Il polimero aumenta la solubilità di AmB di 105 volte con un rapporto molare 12:1 AmB/PEG5kDa-cholane (2:1 rapporto ponderale).
5.- Il sistema AmB/PEG5kDa-cholane forma micelle di 30 nm con le frazioni iderofobiche localizzate nella parte interna delle vescicole. L’anali del potenziale zeta a vari pH (5.5-7.2) ha dimostrato che in superficie le micelle sono quasi neutre. Il PEG5kDa-cholane interagisce con AmB attarverso tre siti di binding a seconda del pH suggerendo che l’interazione con il polimero dipende dallo stato di ionizzazione e aggergazione di AmB.
6.- Dopo liofilizzaizone, il prodotto può essere estempraneamnete risdisperso per formare una dispersione omogenea colloidale. La dispersione è risultata stabile da un punto di vista fisicochimico. Studi condotti con FTIR, DSC and XRD hanno dimostrato che nel prodotto liofilizzato, AmB e PEG5kDa-cholane interagiscono intimamente.
7.- Il rilascio di AmB dale micelle di PEG5kDa-cholane è riusltato avvenire con un profilo bifasico. Il best fitting dei profili di rilascio è stato ottenuto con il modello di Higuchi e Korsmeyer-Peppas.
8.- La tossicità della nuova formualzione è stata testata in termini di emolisi. La nuova formulazione AmB/PEG5kDa-cholane è sempre risultata meno emolitica rispetto al riferimento Fungizone®.
9.- L’attività antifungina di AmB testate contro Candida albicans ha mostrato che AmB/PEG5kDa-cholane è 15% più attiva del farmaco in tampone.
10.- I profili farmacocinetici ottenuti per somministarzione intarvenosa condotti con Ambisome®, Fungizone® e AmB/PEG5kDa-cholane sono risultati significativamente diversi. La costante di eliminazione apparente (Ke) della nuova formulazione è signficativamente (P<0.01) più bassa di quella ottenuta con Ambisome® e Fungizone®. Pertanto, il valore di emivita della nuova formulazione è risultata maggiore. Nei topi la somministarzione intravenosa di 1 mg/kg AmB/PEG5kDa-cholane ha causto una minore sofferenza rispetto alla stessa dose di Fungizone® e Ambisome®.
11.- Gli studi farmacocinetici condotti per somministarzione orale hanno dimostrato che questa formualzione consente di ottenere una maggiore emivita rispetto ad Ambisome® e Fungizone®. L’ AUC0-24 era simile in tutte le formualzioni testate.
12.- Si può quindi concludere che òa nuova formulazione AmB/PEG5kDa-cholane è un sistema di veicolazione promettente in quanto stabile, con minore tossicità rispetto a AmB libera e rispetto al prodotto commericale Fungizone®.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Caliceti, Paolo and Torrado, Juan José and Ballesteros, María Paloma
Ph.D. course:Ciclo 20 > Scuole per il 20simo ciclo > SCIENZE MOLECOLARI > SCIENZE FARMACEUTICHE
Data di deposito della tesi:11 July 2017
Anno di Pubblicazione:11 July 2017
Key Words:amfotericina B, solubilità, PEG5kDa-cholane, attività biologica (amphotericin B, solubility, PEG5kDa-cholane, biological activity)
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/09 Farmaceutico tecnologico applicativo
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze del Farmaco
Codice ID:10438
Depositato il:06 Nov 2017 14:07
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