Vai ai contenuti. | Spostati sulla navigazione | Spostati sulla ricerca | Vai al menu | Contatti | Accessibilità

| Crea un account

Antonucci, Salvatore (2018) Relationships between mitochondrial [Ca2+] and ROS in experimental model of cardiac disease. [Tesi di dottorato]

Full text disponibile come:

[img]Documento PDF
Tesi non accessible fino a 31 Ottobre 2020 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
Visibile a: nessuno

4Mb

Abstract (inglese)

Changes in intracellular [Ca2+] ([Ca2+]I) homeostasis, mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species (ROS) are generally intertwined. Therefore, it is difficult to establish sequence of events and causal relationships. For instance, an increase in [Ca2+]I affects mitochondrial [Ca2+] and in most cases it is associated with an increased mitochondrial ROS formation, leading to the opening of the permeability transition pore (PTP), mitochondrial dysfunction and cell death. On the other hand, ROS modify [Ca2+]I homeostasis by acting at various sites involved in intracellular Ca2+ fluxes. The changes induced by [Ca2+]I on ROS generation and vice versa are very rapid, making it difficult to elucidate the primary event under both physiological and pathological conditions.
ROS are produced at several intracellular sites, and in cardiac myocytes mitochondria are the most redox-active compartment. Mitochondria are very susceptible to oxidation, representing both a source and a target of ROS. Although the enzymes responsible for mitochondrial ROS formation under physiopathological conditions are still a matter of investigation. An additional matter of complexity is related to available techniques. While various methods are available to induce a primary and direct rise in [Ca2+]I, the existing protocols to trigger ROS production are far from being specific. An increase in ROS is generally obtained as a consequence of the exogenous administration of an oxidant (mostly H2O2) or by applying pathological stimuli (i.e., respiratory chain inhibition) that inevitably trigger several other effects, including alterations in [Ca2+]I homeostasis. Here we aimed at solving these issues by evaluating the effects of a primary dose-dependent increase in mitochondrial ROS levels on cell physiology, especially in neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs).
In order to induce a primary increase in mitochondrial ROS levels, we treated NRVMs with a paraquat analogue targeted to mitochondria (Mitochondrial Paraquat, MitoPQ). This compound accumulates selectively in the mitochondrial matrix and elicits ROS formation by means of redox cycling at the flavin site of Complex I of the electron transport chain (ETC). Initially, we established a dose-response curve with different doses of MitoPQ by evaluating ROS formation, mitochondrial function and cell function. We observed that cells exposed to high doses of MitoPQ displayed a dose-dependent increase in mitochondrial ROS levels. High doses led to decreased mitochondrial membrane potential (ΔΨm), PTP opening, impaired cytosolic [Ca2+] homeostasis and cell death.
Subsequently, we wondered whether high doses of MitoPQ could trigger mitochondrial pathway involved in ROS formation. We focused our attention on the activity of monoamine oxidases (MAOs) that have been recently shown to contribute to oxidative stress in cardiac diseases. MAO inhibition prevented MitoPQ-induced ROS formation along with mitochondrial dysfunction and cell death. Besides this amplification pathway, these findings provide the direct evidence that ROS produced within mitochondria can affect cytosolic processes and especially [Ca2+]I.
The cross-talk between Ca2+, ROS and mitochondrial function plays an essential role in diabetic cardiomyopathy (DCM). Therefore we extended the results obtained with MitoPQ, and especially MAO-induced amplification and alterations in [Ca2+]I homeostasis induced by mitochondrial ROS to a cellular model of DCM. NRVMs treated with high glucose (HG) and interleukin-1β (IL-1β) displayed a significant increase in mitochondrial H2O2 levels, both after prolonged (48 h) and short (1 h) treatment. MAO inhibitor pargyline prevented this observed increase in ROS levels. Hence, we tested the effect of MAO inhibition on cytosolic [Ca2+] homeostasis in cells exposed to the diabetes-like protocol. Surprisingly, HG and IL-1β did not perturb significantly Ca2+ oscillatory parameters (i.e. amplitude, frequency and area under curve), while pretreatment with pargyline or N-(2-Mercaptopropionyl)glycine (MPG) worsened contractility defects induced by HG and IL-1β, compromising the oscillatory pattern. These unexpected findings suggest that a basal oxidative tone is necessary for a proper Ca2+ cycling in cardiomyocytes exposed to HG and IL-1β.
Noteworthy, diabetes is related to pancreatic β-cells dysfunction. In pancreatic β-cell, short bursts of ROS have been shown to contribute to [Ca2+]I homeostasis and Ca2+-dependent insulin secretion. Although in diabetes a sustained oxidative stress leads to β-cell dysfunction, a primary and moderate increase in ROS levels could shape Ca2+ transients promoting insulin secretion. We tested this hypothesis on Min6 β-cells, an insulinoma cell line that can be used as a model of diabetes applied to pancreatic β-cells. We evoked a primary increase in intracellular ROS levels by treating Min6 β-cells with aluminium phthalocyanine chloride (AlClPc), a photosensitizer commonly used in photodynamic therapy. Photoactivation of AlClPc induces chemical changes into neighboring molecules leading to ROS production in amount depending on the intensity of the LED illumination. Results obtained showed that modulation of ROS induced by photoactivation of AlClPc or Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPases (SERCA) inhibition by thapsigargin (Tg) resulted in acceleration of Ca2+ to a similar degree, indicating that a primary and controlled increase in cytosolic ROS levels modifies but not abolishes Ca2+ oscillation via a modulation of SERCA.
Overall, our data showed that low levels of mitochondrial ROS slightly modulate [Ca2+]I homeostasis without affecting mitochondrial and cell function. On the other hand, mitochondrial ROS can be elevated by increase in mitochondrial Ca2+ uptake. We used this notion to investigate whether mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU) overexpression could modify mitochondrial ROS formation and consequently mitochondrial and cardiomyocyte viability. Cells overexpressing MCU displayed an increase in ROS levels that was causally related to an increased tolerance to anoxia/reoxygenation (A/R) injury in a process that involved AKT activation. These findings demonstrate that a slight increase in mitochondrial ROS formation exerts a protective effect. To test this hypothesis, we investigated whether mitochondrial ROS induced by low doses of MitoPQ could decrease the susceptibility to A/R injury. Not only this hypothesis was verified, but also in this case protection was due to AKT activation.
The data from this work demonstrate that mitochondrial ROS formation can trigger a wide array of responses with a clear separation between ROS levels required to elicit beneficial or detrimental effects. Changes in [Ca2+]I homeostasis can be upstream but also downstream of mitochondrial ROS formation and the cardioprotective effect linked to a slight increase in mitochondrial ROS levels appears to depend on AKT activation.

Abstract (italiano)

Variazioni dell’omeostasi del [Ca2+] ([Ca2+]I) intracellulare, disfunzione mitocondriale e specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono generalmente interconnessi. Di conseguenza, è difficile stabilire una sequenza di eventi e relazioni di causa ed effetto. Per esempio, un aumento di [Ca2+]I influenza il [Ca2+] mitocondriale e, in molti casi, è associato con un aumento di ROS mitocondriali che portano all’apertura del poro di transizione mitocondriale (PTP), disfunzione mitocondriale e morte cellulare. D’altro canto, i ROS modificano l’omeostasi del [Ca2+]I interagendo con vari siti coinvolti nei flussi di Ca2+ intracellulari. I cambiamenti indotti dal [Ca2+]I sulla formazione dei ROS e viceversa sono molto rapidi, rendendo difficile definire l’evento primario sia in seguito sia ad un evento fisiologico che ad un evento patologico.
I ROS sono prodotti in vari siti intracellulari e nei cardiomiociti i mitocondri sono il compartimento a più alto potenziale ossidoriduttivo. I mitocondri sono molto sensibili all’ossidazione, rappresentando sia una fonte che un bersaglio dei ROS. Tuttavia gli enzimi responsabili per la formazione dei ROS mitocondriali in condizioni patofisiologiche sono ancora motivo di discussione. Un’ulteriore complicazione è legata alle tecniche disponibili. Mentre esistono vari metodi per indurre un aumento primario e diretto di [Ca2+]I, i protocolli esistenti per innescare una produzione di ROS sono tutt’altro che specifici. Un aumento di ROS è in genere ottenuto come conseguenza della somministrazione di un ossidante esogeno (soprattutto H2O2) o applicando stimoli patologici (i.e. inibizione della catena respiratoria) che innescano inevitabilmente diversi altri effetti, incluse alterazioni nell’omeostasi del [Ca2+]I. In questo lavoro ci poniamo come obiettivo la risoluzione di questi problemi valutando gli effetti di un aumento primario dose-dipendente dei livelli di ROS mitocondriali sulla fisiologia cellulare, specialmente in cardiomiociti neonatali di ratto (NRVMs).
Per indurre un aumento primario dei livelli di ROS mitocondriali, abbiamo trattato i NRVMs con un analogo del paraquat diretto ai mitocondri (Mitochondrial Paraquat, MitoPQ). Questo composto si accumula selettivamente nella matrice mitocondriale e provoca la formazione di ROS per mezzo di un meccanismo ossidoriduttivo che coinvolge il complesso flavinico del complesso I della catena di trasporto degli elettroni (ETC). Inizialmente, abbiamo stabilito una curva dose-risposta con dosi diverse di MitoPQ valutando la formazione di ROS, la funzione mitocondriale e la funzione della cellula. Abbiamo osservato che cellule trattate con alte dosi di MitoPQ mostravano un aumento dose-dipendente dei livelli di ROS mitocondriali. Alti dosaggi hanno portato ad una diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm), apertura del PTP, omeostasi citosolica del [Ca2+] compromessa e morte cellulare.
Successivamente, ci siamo chiesti se alte dosi di MitoPQ potessero innescare vie di segnalazione mitocondriali coinvolte nella formazione dei ROS. Ci siamo focalizzati sull’attività delle monoammino ossidasi (MAOs) che sono state recentemente identificate come contribuenti dello stress ossidativo nelle patologie cardiache. L’inibizione della MAO ha prevenuto la formazione di ROS indotta dal MitoPQ, così come la disfunzione mitocondriale e la morte cellulare. Oltre a questa via di amplificazione, questi risultati forniscono la prova diretta che i ROS prodotti nei mitocondri possono influenzare i processi citosolici, specialmente l’omeostasi del [Ca2+]I.
L’interazione tra Ca2+, ROS e funzione mitocondriale ha un ruolo essenziale nella cardiomiopatia diabetica (DCM). Pertanto abbiamo esteso i risultati ottenuti con il MitoPQ, specialmente l’amplificazione indotta dalla MAO e l’alterazione dell’omeostasi del [Ca2+]I indotta dai ROS mitocondriali, a un modello cellulare di DCM. NRVMs trattati con alti livelli di glucosio (HG) e interleuchina-1β (IL-1β) hanno manifestato un aumento significativo di livelli di H2O2 mitocondriale, sia dopo un trattamento prolungato (48 h) che breve (1 h). L’inibitore della MAO pargilina ha prevenuto questo aumento dei livelli di ROS. Quindi, abbiamo testato l’effetto dell’inibizione della MAO sull’omeostasi del [Ca2+] citosolico in cellule trattate con il protocollo diabetico. Sorprendentemente, HG e IL-1β non hanno modificato significativamente i parametri oscillatori del Ca2+ (i.e. ampiezza, frequenza, area sotto la curva), mentre il pretrattamento con la pargilina o con la N-(2-Mercaptopropionil)glicina (MPG) ha peggiorato il difetto di contrattilità indotto da HG e IL-1β, compromettendo le oscillazioni. Questo risultato inaspettato suggerisce che un tono ossidativo di base sia necessario per un appropriato riciclo del Ca2+ in cardiomiociti trattati con HG e IL-1β.
Bisogna sottolineare che il diabete è correlato alla disfunzione delle β cellule pancreatiche. Nelle β cellule pancreatiche è stato dimostrato che lievi scariche di ROS contribuiscono all’omeostasi del [Ca2+]I e la secrezione di insulina dipendente dal Ca2+. Nonostante nel diabete un marcato stress ossidativo conduca alla disfunzione delle β cellule, un aumento primario e moderato di ROS potrebbero modulare i transienti di Ca2+ promuovendo la secrezione di insulina. Abbiamo testato quest’ipotesi sulle β cellule Min6, una linea cellulare di insulinoma che può essere usata come modello di diabete applicato alle β cellule pancreatiche. Abbiamo innescato un aumento di livello di ROS intracellulari trattando le Min6 con alluminio ftalocianina cloruro (AlClPc), un fotosensitizzatore comunemente usato in terapia fotodinamica. La fotoattivazione dell’AlClPc induce cambiamenti chimici nelle molecole circostanti inducendo la produzione di ROS in quantità dipendente dall’intensità dell’illuminazione del LED. I risultati ottenuti hanno evidenziato che la modulazione dei ROS indotta dalla fotoattivazione dell’AlClPc o l’inibizione della pompa Calcio/ATPasi del reticolo endoplasmico (SERCA) per mezzo della tapsigargina (Tg) hanno indotto una simile accelerazione delle oscillazioni di Ca2+, suggerendo che un aumento primario e controllato dei livelli di ROS citosolici modificano ma non bloccano le oscillazioni di Ca2+ modulando la SERCA.
I nostri dati mostrano che bassi livelli di ROS mitocondriali modulano leggermente l’omeostasi di [Ca2+]I senza interferire con la funzione mitocondriale e citosolica. Abbiamo usato quest’informazione per studiare se la sovraespressione del trasportatore di Ca2+ mitocondriale (MCU) potesse modificare la formazione di ROS mitocondriali e conseguentemente la sopravvivenza mitocondriale e cellulare dei cardiomiociti. Cellule sovraesprimenti MCU hanno mostrato un aumento nei livelli di ROS che era correlato causalmente ad un aumento della tolleranza al danno da anossia/riossigenazione (A/R) in un processo che ha coinvolto l’attivazione di AKT. Queste scoperte dimostrano che un leggero aumento della formazione di ROS mitocondriali produce un effetto protettivo. Per testare quest’ipotesi, abbiamo studiato se i ROS mitocondriali indotti da basse dosi di MitoPQ potessero diminuire la suscettibilità al danno da A/R. Non solo quest’ipotesi è stata verificata, ma anche in questo caso la protezione è stata attribuita all’attivazione di AKT.
I dati di questo lavoro dimostrano che la formazione di ROS mitocondriali può innescare un ampio spettro di risposte con una chiara separazione tra livelli di ROS richiesti per evocare effetti benefici o dannosi. Cambiamenti nell’omeostasi del [Ca2+]I possono essere a monte ma anche a valle della formazione dei ROS mitocondriali e l’effetto cardioprotettivo collegato al leggero aumento dei livelli di ROS mitocondriali sembra dipendere dall’attivazione di AKT.

Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Di Lisa, Fabio
Correlatore:Kaludercic, Nina
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 30 > Corsi 30 > SCIENZE BIOMEDICHE SPERIMENTALI
Data di deposito della tesi:05 Gennaio 2018
Anno di Pubblicazione:05 Gennaio 2018
Parole chiave (italiano / inglese):Calcium, ROS, Reactive oxygen species, Ischemia, Reperfusion, AKT, mitochondria, homeostasis, heart, cardiomyocytes, ptp, permeability transition pore
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/04 Patologia generale
Struttura di riferimento:Centri > Centro Interdipartimentale di servizi A. Vallisneri
Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Biomediche
Codice ID:10558
Depositato il:08 Nov 2018 10:41
Simple Metadata
Full Metadata
EndNote Format

Solo per lo Staff dell Archivio: Modifica questo record