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Stagni, Camilla (2017) Genomic analysis in cutaneous melanoma: a tool for predictive biomarker identification and molecular classification. [Ph.D. thesis]

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Thesis not accessible until 31 October 2020 for intellectual property related reasons.
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Abstract (english)

Project 1. Identification of molecular signatures associated with response to MAPK inhibitors.
BRAF V600-mutated melanoma benefits from MAPK inhibitors-based therapy. Yet, the onset of resistance impacts long-term efficacy and can even be immediate. In this study, we examined the genetic alterations characterizing melanoma progression to identify predictive factors of response to MAPK inhibitors (MAPKi). Specifically, we evaluated BRAF copy number variation (CNV), BRAF mutant (BRAFmut) allele frequency, PTEN loss or mutations and TERT promoter mutations in pre-treatment melanoma specimens from MAPKi-treated patients (pts) and we analyzed their association with progression free survival (PFS). We also applied a comprehensive unbiased approach, using genome-wide CNV analysis, to identify additional genomic aberrations potentially associated with response to therapy.
We found that 65% pts displayed BRAF gains, often supported by chromosome 7 polysomy. In addition, we observed that 64% pts had a balanced BRAF mutant/wild-type allele ratio, while 14% and 23% pts had low and high BRAFmut allele frequency, respectively. Notably, a significantly higher risk of progression was observed in pts with a diploid BRAF status vs. those with BRAF gains (HR = 2.86; 95% CI 1.29‒6.35; p = 0.01) and in pts with low vs. those with a balanced BRAFmut allele percentage (HR = 4.54, 95% CI 1.33‒15.53; p = 0.016).
We identified PTEN gene mutations affecting the catalitic and C2 domains in 27% pts. Moreover, we observed a complete PTEN loss in 42% pts, partial loss in 35% pts and no loss in 23% pts. Of note, we found PTEN loss also in pre-treatment samples from pts with long PFS.
Sequencing of TERT promoter gene disclosed mutations in 78% pts. The -124C>T and the -146C>T mutations were equally frequent (36%) while the -138-139CC>TT was present only in 5% pts. Fifty-one % pts carried also the neighboring polymorphism rs2853669, which reportedly counteracts the activating effect of the above-mentioned mutations on TERT expression. Upon stratification of the TERT promoter mutant cohort based on presence/absence of the polymorphism, TERTmutant/SNPcarrier pts showed a trend toward better PFS (median PFS 11.5 mo., 95% CI 3.12‒19.88) compared to TERTmutant/SNPnon-carrier pts (median PFS 7 mo., 95% CI 4.27‒9.72). When stratifying based on mutation type, the -146C>T mutation correlated with shorter PFS (median PFS 5.45 mo., 95% CI 2.80‒9.20) compared to the -124C>T one (median PFS 15.2 mo., 95% CI 5.57‒).
Genome-wide CNV analysis pointed at chr3p24, chr3p21.2 and chr17p13.1, which are differently alterated between pts with long and short time to disease progression, as regions of potential interest to identify new genes involved in therapeutic resistance.
Our data suggest that quantitative analysis of the BRAF gene and sequencing of the TERT promoter gene could be useful to select the melanoma pts who are most likely to benefit from MAPKi therapy. In addition, chromosome 3 and 17 could be regions that warrant further investigation. Conversely, because PTEN loss was present in pre-treatment samples from pts with both short and long PFS, the assessment of PTEN gene status does not seem to provide information about patient responsiveness to treatment.

Project 2. Research of molecular biomarkers to classify the acral melanoma.
Acral lentiginous melanoma (ALM) is a rare subtype of cutaneous melanoma with specific morphological, epidemiological, and genetic features. Since the genomic landscape of ALM is still incompletely described, we used whole genome CNV analysis to characterize ALM and detail the genomic signatures that differentiate ALM from non-acral melanoma (NAM).
We observed that the most strikingly different copy number aberrations were a higher frequency of losses of chromosome 16q24.2-16q24.3 in ALM than in NAM (64.7% vs. 10%) and a lower frequency of gains of chromosome 7q21.2-7q33 in ALM than in NAM (26.5% vs.79.5%). We observed also that ALM more often (than NAM) harbored clusters of breakpoints and isochromosomes. Moreover, in ALM we identified focal amplification of TERT, CCND1, MDM2 and MITF. In NAM, instead, we found only two focal amplifications, involving BRAF and MITF. Focal homozygous copy losses affected especially the CDKN2A and PTEN genes, both in ALM and in NAM, even though they were more frequent in the latter group.
In keeping with previous observations that led to classify ALM as a distinct molecular subtype of melanoma, we observed a peculiar genomic landscape in ALM (vs. NAM). Our study provides insights into the molecular characteristics of ALM, which is key to full elucidation of its pathogenesis.

Abstract (italian)

Progetto 1: identificazione di signatures molecolari associate alla risposta al trattamento con inibitori del MAPK pathway.
I melanomi portatori di una mutazione nel codone V600 del gene BRAF rispondono agli inibitori del MAPK pathway, ma l’efficacia a lungo termine di questa terapia è limitata dallo sviluppo di resistenza, talvolta immediata. In questo studio, abbiamo esaminato le alterazioni molecolari caratterizzanti la progressione del melanoma al fine di identificare fattori predittivi di risposta/resistenza ai MAPK-inibitori. Nello specifico, su una serie di campioni pretrattamento di pazienti affetti da melanoma, trattati con MAPK-inibitori, abbiamo valutato numero di copie del gene BRAF e percentuale di allele V600-mutato, delezione e mutazioni di PTEN, alterazioni del promotore di TERT, e ne abbiamo analizzato l’associazione con la risposta dei pazienti alla terapia. Inoltre, abbiamo determinato il copy number variation dell’intero genoma dei nostri campioni per individuare ulteriori aberrazioni non note potenzialmente associate con la risposta alla terapia.
Abbiamo identificato un numero aumentato di copie (gain) del gene BRAF, spesso dovuto a polisomia del cromosoma 7, nel 65% dei pazienti; l’allele mutato è stato trovato in una percentuale compresa tra il 35% e il 65% nel 64% dei pazienti, inferiore al 35% nel 14% dei pazienti e superiore al 65% nel 23% dei pazienti. Dall’analisi di sopravvivenza, è risultato che i pazienti con BRAF diploide o una percentuale di allele mutato inferiore al 35% presentano un più alto rischio di progressione rispetto a coloro che presentano gain di BRAF (HR=2.86; 95% CI 1.29-6.35; p=0.01) o tra il 35% e il 65% di allele mutato (HR=4.54,CI 1.33-15.53; p=0.016), rispettivamente.
L’analisi di PTEN ha rivelato la presenza di mutazioni nel 27% dei pazienti, localizzate a livello dei domini catalitico e C2 della proteina codificata; inoltre, il 42% dei casi valutati mostrava una delezione completa del gene, il 35% una delezione parziale, mentre nel 23% dei pazienti non è stata individuata alcuna aberrazione di PTEN. Da notare, delezioni di PTEN sono emerse sia nei casi di melanoma resistente alla terapia, che in quelli che avevano risposto a lungo.
Il sequenziamento del promotore del gene TERT ha permesso l’identificazione di mutazioni nel 78% dei pazienti. Le mutazioni -124C>T e -146C>T mostravano la stessa frequenza (36%) nella nostra coorte, mentre la -138-139CC>TT è stata individuata solo nel 5% dei casi. Il 51% dei pazienti presentava inoltre lo SNP rs2853669, noto per contrastare l’effetto attivante delle mutazioni sull’espressione di TERT. Stratificando la coorte di pazienti mutati in base alla presenza/assenza del polimorfismo, i pazienti TERT mutati/SNP carriers mostravano un trend verso una migliore PFS (PFS mediana 11.5 mesi, 95% CI 3.12-19.88) rispetto ai TERT mutati/SNP non-carriers (PFS mediana 7 mesi, 95% CI 4.27-9.72). La mutazione -146C>T, inoltre, correlava con PFS più breve (PFS mediana 5.45 mesi, 95% CI 2.80-9.20) rispetto alla -124C>T (PFS mediana 15.2 mesi, 95% CI 5.57-).
Dall’analisi del copy number variation (CNV) sull’intero genoma, le regioni chr3p24, chr3p21.2 e chr17p13.1 hanno mostrato pattern di alterazioni diverse in pazienti responsivi vs. non-responsivi alle terapie; risultano pertanto regioni di potenziale interesse per l’individuazione di nuovi geni coinvolti nella resistenza alla terapia.
I nostri dati suggeriscono dunque che l’analisi quantitativa del gene BRAF e il sequenziamento del promotore di TERT costituiscono un utile strumento di selezione dei pazienti con maggiore probabilità di rispondere alla terapia con MAPK-inibitori, contrariamente alla valutazione dello status di PTEN. L’analisi genome-wide, invece, indica di approfondire lo studio dei cromosomi 3 e 17.

Progetto 2: ricerca di marcatori biomolecolari per la classificazione del melanoma acrale.
Il melanoma acrale lentigginoso è un raro sottotipo di melanoma cutaneo con specifiche caratteristiche morfologiche, epidemiologiche e genetiche. Poiché il genoma del melanoma acrale non è ancora stato pienamente caratterizzato, ne abbiamo analizzato il CNV per individuare quei caratteri genomici peculiari che lo differenziano dal melanoma non acrale.
La nostra analisi genome-wide ha evidenziato una maggiore frequenza di delezioni della regione 16q24.2-16q24.3, gains meno frequenti nella regione 7q21.2-7q33, una più accentuata frammentazione genomica e numerosi isocromosomi come caratteri che distinguono il melanoma acrale dal non acrale. Abbiamo inoltre identificato amplificazioni focali nei geni TERT, CCND1, MDM2 e MITF, più rare nei non acrali, laddove interessavano altri geni, come BRAF e MITF. Delezioni focali sono state individuate soprattutto nei geni CDKN2A e PTEN in entrambi i sottotipi di melanoma, anche se più frequenti nei non acrali.
I nostri dati, in accordo con il classificare il melanoma acrale come tipo distinto di melanoma, hanno consentito di delinearne alcune delle peculiarità genomiche, chiave per elucidarne anche la patogenesi.

EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Menin, Chiara and De Nicolo, Arcangela
Ph.D. course:Ciclo 30 > Corsi 30 > ONCOLOGIA CLINICA E SPERIMENTALE E IMMUNOLOGIA
Data di deposito della tesi:12 January 2018
Anno di Pubblicazione:2017
Key Words:melanoma, BRAF, target therapy, melanoma acrale
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/06 Oncologia medica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chirurgiche Oncologiche e Gastroenterologiche
Codice ID:10569
Depositato il:25 Oct 2018 16:52
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