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Ferlazzo, Giorgia Maria (2018) Dissecting the molecular function of mutant Huntingtin with stem cells. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Huntington’s disease (HD) is an incurable neurodegenerative disorder caused by CAG expansion in Htt locus leading to loss of striatal neurons.
Here, I described here a full methodology to perform a gain-of-function screening wih ES cells, that I used to obtain an understanding of the molecular mechanism of action of mutant Htt protein. Differently from conventional screenings for HD, the approach I developed is based on the use of mammalian (mouse) ES cell system and takes advantage of state of the art technology of piggyBac vector for achieving random genome-wide mutagenesis.
A preliminary screening for regulators of SRF pathway, advantaged by availability of a fluorescent reporter for SFR activity, was set up in order to acquire technical expertise required for the screening procedure.
Subsequently, I carried out gain-of-function screen on ES cell lines stably expressing mutant Htt (Q128 Htt), characterized them and observed impaired proliferation and increased sensitivity to exogenous stressors. I performed mutagenesis on Q128 Htt cells and screened for rare clones surviving to mutant Htt toxicity thanks to over-activation of some genes.
By Sp-PCR I succeeded in identification of a set of candidate genes that are potentially able to reduce the toxic effects of mutant Htt. Such genes will be also tested in more relevant model systems, such as immortalized striatal neurons expressing mutant Htt and animal models and will represent novel promising therapeutic targets for HD.

Abstract (italian)

La Corea di Huntington (o Huntington Disease, HD) e’ causata dalla espansione di tripletta CAG nel gene HTT. Tale mutazione risulta essere letale per i neuroni dello striato. Lo scopo del progetto è eseguire uno screening funzionale utilizzando cellule embrionali staminali (ES) per meglio comprendere i meccanismi molecolari attraverso i quali la proteina Huntingtin agisce.
Uno screening preliminare per regolatori della via di segnalazione di SRF, facilitato dall’utilizzo di un costrutto fluorescente in grado di monitorarne l’attività, mi ha permesso di acquisire tutte le competenze tecniche necessarie per lo sviluppo della procedura di screening.
Una volta ottimizzata la tecnica, ho realizzato lo screening per HD. Ho innanzitutto generato cellule ES che esprimono Huntingtin mutata e osservato difetti nella proliferazione ed aumentata sensibilità ad agenti stressanti. Ho poi eseguito mutagenesi inserzionale mediata da retrotrasposoni che mediano integrazioni casuali nel genoma e determinano l’attivazione di geni fiancheggianti. Tali geni sono stati identificati come potenziali riduttori degli effetti tossici di Htt mutata. I 3 candidati più promettenti saranno a breve testati in modelli di malattia quali neuroni stratali ed animali transgenici.

EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Martello, Graziano
Ph.D. course:Ciclo 30 > Corsi 30 > MEDICINA MOLECOLARE
Data di deposito della tesi:15 January 2018
Anno di Pubblicazione:15 January 2018
Key Words:cellule staminali embrionali; screening genetico; corea di huntington/embryonic stem cells; genetic screening; huntington disease
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Medicina Molecolare
Codice ID:10923
Depositato il:25 Oct 2018 16:40
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