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Carraro, Roberta (2018) Genomic prediction of resistance to Photobacterium damselae subsp. piscicida and Sparicotyle chrysophrii in gilthead seabream (Sparus aurata) using 2B-RAD sequencing. [Tesi di dottorato]

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Tesi non accessible fino a 24 Ottobre 2019 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
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2406Kb

Abstract (inglese)

Context: Gilthead seabream (Sparus aurata) is a highly important farmed fish species specifically in the Mediterranean aquaculture industry. Infectious diseases present a significant threat to the sustainability of aquaculture with high economic losses due to mortalities, reduced productivity, and the necessity of additional treatments/vaccinations. Specific and sensitive methods for the detection of fish pathogens represent useful tools to investigate infection dynamics and enable early detection of the disease for better prevention. Selection and breeding for resistance against infectious diseases is also a highly valuable tool to help prevent or diminish disease outbreaks, and applying genomic information to the currently available advanced selection methods could accelerate the response to selection. The gram-negative bacteria Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) and the ectoparasite Sparicotyle chrisophrii (Sc) are two of the most important pathogens affecting seabream cultivation. Purpose of the study: The aims of this work are: (i) to investigate the genomic prediction of resistance to two highly problematic diseases in seabream through the application of 2b-RAD with the objective of achieving selective breeding goals and (ii) to design an effective assay for the detection and quantification of Phdp. Materials and methods: (i) 1233 and 1001 seabream individuals were challenged trough intramuscular injection with a virulent strain of Phdp and by co-habitation with naturally Sc-infected seabreams, respectively. Animals were monitored daily and data of dead/survived fish and number of parasites in the gills/body length were recorded. Genomic DNA was extracted from the finfish of all individuals and used to construct 2b-RAD libraries. Data were analyzed in order to find SNP based genotypes (GATK, SAMtools), perform Genome-Wide Association Studies, estimate breeding values (ASReml 4.0) and construct linkage-maps (Lep-Map v2). (ii) A primer set was designed from a partial sequence of the bamB gene (Primer3 web) considering two SNPs that discriminate between Phdp and its strictly correlated subspecies Phdd. The assay was tested for specificity/sensitivity on laboratory-generated samples as well as on previous experimentally infected seabream tissue samples. Results and discussion: (i) The reference catalogue contained 175,725 and 269,660 tags for the Phdp and the Sc challenge, respectively. The SNP detection process yielded genotypic data for 19,313 and 21,773 quality SNPs for Phdp and Sc, respectively, both grouped into 24 linkage groups (LG), which are consistent with the karyotype of this species. Genomic heritability for resistance to photobacteriosis was 0.31-0.33 and genomic heritability for tolerance to Sc was 0.11-0.22, suggesting potential to enhance both resistances through family-based selection. Estimated breeding values (EBV) using genomic (GBLUP) information presented 5-43% higher accuracy in comparison to those measured using the only pedigree information (PBLUP). GWAS revealed a quantitative trait locus (QTL) including 7 SNPs at LG17 which presented significant association with resistance to Phdp, while one SNP (LG17) was found affecting tolerance to Sc. (ii) The molecular method proposed for P. damselae diagnosis, with high specificity and sensitivity, proved to be suitable for detection, quantification and subspecies identification in one-step, overcoming the limitations of previous assays. Conclusions: The SNPs discovered through 2b-RAD genotyping could be used to implement new marker-assisted selection programs for the generation of more resistant fish, preventing important disease outbreaks in fish farms. In addition, the original molecular method proposed holds the potential to improve the current knowledge of Phdp infection dynamics and the development of better strategies to control this important fish disease.

Abstract (italiano)

Contesto: L’ orata (Sparus aurata) è una specie ittica molto importante per il settore dell'acquacoltura nel Mediterraneo. Le malattie infettive rappresentano una minaccia significativa per questo settore, provocando elevate perdite economiche dovute a mortalità, riduzione della produttività e la necessità di trattamenti / vaccinazioni aggiuntivi. Metodi specifici e sensibili per il rilevamento di patogeni rappresentano strumenti utili per studiare le dinamiche di infezione e consentirne una diagnosi precoce per una migliore prevenzione. La selezione per la resistenza alle malattie infettive rappresenta anch’essa uno strumento prezioso per aiutare a prevenire o ridurre i focolai di malattie; l'applicazione delle informazioni genomiche ai metodi di selezione avanzati attualmente disponibili, potrebbe accelerare la risposta alla selezione. Il batterio gram-negativo Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) e l'ectoparassita Sparicotyle chrysophrii (Sc) sono due importanti patogeni che colpiscono la coltivazione delle orate. Scopo dello studio: Gli obiettivi di questo lavoro sono: (i) studiare la previsione genomica della resistenza a due malattie altamente problematiche in orata attraverso l'applicazione di strumenti genomici innovativi (2b-RAD) e (ii) progettare un saggio efficace per il rilevamento e la quantificazione di Phdp. Materiali e metodi: (i) 1233 e 1001 individui di orata sono stati infettati sperimentalmente rispettivamente tramite iniezione intramuscolare con un ceppo virulento di Phdp e per co-abitazione con orate naturalmente infette da Sc. I pesci sono stati monitorati giornalmente. In questo contesto sono stati registrati dati quali numero morti / sopravvissuti, numero di parassiti nelle branchie / lunghezza. Il DNA genomico è stato estratto da tessuto di pinna da tutti gli individui e utilizzato per costruire le librerie 2b-RAD. I dati sono stati analizzati al fine di trovare i genotipi basati su SNPs (GATK, SAMtools), eseguire genome-wide association studies (GWAS), stimare i parametri genetici (ASReml 4.0) e costruire mappe di linkage (Lep-Map v2). (ii) Un set di primer è stato progettato su una porzione di sequenza del gene bamB (Primer3 web) considerando due SNP che discriminano tra Phdp e la specie a cui esso è strettamente correlato, Phdd. Il saggio è stato testato per specificità / sensibilità sia su campioni generati in laboratorio che su campioni di tessuto di orata precedentemente infettati sperimentalmente. Risultati e discussione: (i) Il catalogo di riferimento è risultato contenere rispettivamente 175.725 e 269.660 per gli esperimenti con Phdp e Sc. La SNP discovery ha prodotto dati genotipici per 19.313 e 21.773 SNP di alta qualità per Phdp e Sc, rispettivamente, entrambi raggruppati in 24 gruppi di linkage (LG), sono coerenti con il cariotipo di questa specie. L'ereditabilità genomica per la resistenza alla fotobatteriosi è risultata 0,31-0,33 mentre l'ereditabilità genomica per la tolleranza a Sc 0,11-0,22, suggerendo l’esistenza di un potenziale per migliorare entrambe le resistenze attraverso la selezione. Le stime dei valori riproduttivi (EBV) mediante informazioni genomiche (GBLUP) hanno presentato un'accuratezza del 5-43% superiore rispetto a quelle misurate utilizzando le sole informazioni del pedigree (PBLUP). La GWAS ha rivelato un quantitative trait locus (QTL) comprendente 7 SNPs nel LG17, avente un'associazione significativa con la resistenza al Phdp, mentre uno SNP (LG17) è stato riscontrato influenzare la tolleranza a Sc. (ii) Il metodo molecolare proposto per la diagnosi di P. damselae, con un'elevata specificità e sensibilità, si è dimostrato idoneo per l'individuazione, la quantificazione e l'identificazione delle due sottospecie in un unico step, superando i limiti delle analisi precedenti. Conclusioni: gli SNPs scoperti attraverso la genotipizzazione 2b-RAD potrebbero essere utilizzati per implementare nuovi programmi di selezione assistita da marcatori per la generazione di pesci più resistenti, prevenendo importanti epidemie in allevamenti ittici. Inoltre, l’innovativo metodo molecolare proposto potrebbe migliorare l'attuale conoscenza delle dinamiche dell'infezione da Phdp e lo sviluppo di migliori strategie per controllare questa importante malattia in orata.

Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Patarnello, Tomaso
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 30 > Corsi 30 > SCIENZE VETERINARIE
Data di deposito della tesi:23 Gennaio 2018
Anno di Pubblicazione:22 Gennaio 2018
Parole chiave (italiano / inglese):Genomic prediction, seabream, Photobacterium damselae subsp. piscicida, Sparicotyle chrysophrii, 2b-RAD, real-time PCR
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > VET/03 Patologia generale e anatomia patologica veterinaria
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biomedicina Comparata ed Alimentazione
Codice ID:11043
Depositato il:31 Ott 2018 09:15
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