Molecular Characterization of VHL Family Proteins: when Similarities make the Difference

Mutations of the so-called cancer-susceptibility genes impair the biological function of key factors1 as observed for the human von Hippel-Lindau (VHL) oncosuppressor gene. Individuals carrying loss-of-function mutations on the VHL gene develop a familial autosomal-dominant cancer predisposition referred as von Hippel-Lindau syndrome (VHL, OMIM 193300), characterized by benign or malign tumors and cysts diffused in patients organs2. The best-known pVHL30 function in healthy cells is its role in regulating the hypoxia-inducible transcription factor 1α (HIF-1α), which in turn mediates the adaptive response to hypoxia. This mechanism would sustain the cancer development whether altered. Although VHL syndrome is classified as an inherited disease, the genotype-phenotype correlation is not fully explained. Indeed, pVHL is classified as a multipurpose hub protein able to interact with more than 500 proteins3 participating different cellular functions. The protein interacting network centered on pVHL has been deeply investigated over the years, in order to clarify the functional implications of these interactions. My PhD program was aimed to identify and characterize novel pVHL interactors through a combination of computational and experimental approaches. I identified a novel pVHL interaction with the cyclin-dependent inhibitor kinase 1 subfamily (CDKN1s). Their association resembles the pVHL/HIF-1α complex formation by involving both the pVHL30 β-domain and a CODD-like motif, which was found to localize within the linear CDKN1s N-terminal domain. The pVHL30 plasticity has been further investigated to include the pVHL172 isoform and VLP, the only known human pVHL paralog. In particular, interactions with HIF-1α, CDKN1s and MDM2, a novel pVHL interactor identified in a parallel work at my host laboratory, have been evaluated revealing isoform-specific bindings. Data generated during my PhD suggest a role for the pVHL disordered N-terminus in discriminating isoform-specific interactions. Confocal microscopy experiments aimed at characterizing the biochemical properties of pVHL-related proteins were then performed. Resulting data indicated pVHL30 and pVHL172 to assume a diffuse distribution in mammal cells, whereas both pVHL19 and VLP, which lack (or partially lack) of an extended N-terminus appear to localize in cytosolic punctate structures. The same behavior was also observed for the truncated mutant pVHL172-ΔNT, which indirectly supports a role for this accessory tail in regulating pVHL localization. Biochemical fractionation assays show that members of VHL-family presenting with the N-terminus are mostly recovered in the soluble fraction. Instead, N-terminus loss markedly increases the insoluble protein fraction. Collectively taken, these findings suggest the existence of distinct functional role for each member of the pVHL protein family, revealed in this work as isoforms-specific protein-protein association and intracellular localization. Intriguingly, the novel interactions and biochemical evidences were also supported by validation in human cell. In light of these meaningful findings, I performed a tissue-specific genome-wide cDNA library screening to investigate the unknown VLP interactome. A total of 96 interacting fragments, each corresponding to a different protein, were collected and sequenced. A preliminary computational analysis revealed that VLP binding partners mostly localize in nucleus and cytosol, while participating three major functional pathways (i.e. regulation of extracellular adhesion, cytoskeleton remodeling, as well as cell survival and proliferation). In addition, a number of these new interactors are characterized by functional domains typically found in scaffold proteins, such as WD, LIM, ARM and zinc finger, thus suggesting a VLP role in participating multiple protein complexes. More in general, considering both the novelty of this tissue-specific library, ubiquitous pVHL-expression and their structural similarity, it can be speculated that at least a subset of these new VLP interactions can be also extended to pVHL, possibly representing an example of tissue-specific pVHL-partners. Their experimental validation, for example using VHL30 as bait in a similar environment, will be crucial to address this hypothesis. On the other hand, the VLP-specific proteome may derive by gene specialization evolved to account for tissue-specific requirements. If confirmed, these data may help to explain how functional impairment of the VHL-protein family promotes cancer insurgence.

Le mutazioni che colpiscono i cosiddetti “geni di suscettibilità al cancro” alterano la funzione biologica di alcune proteine chiave, come nel caso del gene oncosoppressore von Hippel-Lindau (VHL). Individui portatori di mutazioni loss-of-function sul gene VHL sviluppano una predisposizione famigliare autosomica dominante al cancro, chiamata sindrome di von Hippel-Lindau (VHL, OMIM 193300). La patologia è caratterizzata dalla diffusione di tumori o cisti, benigni o maligni, in differenti organi2. Nelle cellule sane, la funzione maggiormente nota di pVHL30 riguarda la regolazione del fattore di trascrizione HIF-1α, il quale a sua volta media e regola la risposta adattiva all’ipossia. Se alterato, questo meccanismo di regolazione può sostenere lo sviluppo tumorale. Nonostante la sindrome VHL sia classificata come famigliare predisposizione al cancro, la correlazione tra genotipo e fenotipo non risulta univoca nei pazienti. Ciò potrebbe trovare spiegazione nelle caratteristiche intrinseche della proteina in questione. pVHL30 viene infatti classificata come hub multifunzionale capace di interagire con più di 500 diversi interattori3, partecipando così a differenti funzioni cellulari. La fitta rete di interazioni proteiche attorno a pVHL30 è stata ampiamente studiata negli anni, con lo scopo di chiarirne le implicazioni funzionali. Per questo, durante il mio percorso di dottorato, ho cercato di caratterizzare nuovi interattori di pVHL30 combinando approcci computazionali e sperimentali. Dagli esperimenti, è emersa una nuova associazione tra pVHL30 e la famiglia degli inibitori delle chinasi ciclina-dipendenti 1 (CDKN1), strutturalmente simile al legame tra pVHL30 ed HIF-1α. L’interazione infatti coinvolge sia il dominio β di pVHL30 sia la regione N-terminale delle proteine CDKN1, nella quale è contenuto il dominio CDI caratterizzato da un motivo CODD-like. Inoltre, la plasticità di pVHL30 è stata studiata sfruttando sia pVHL172, isoforma alternativa del gene VHL, sia la proteina paralogo VLP. In particolare, sono state valutate le interazione con HIF-1α, CDKN1 e MDM2, quest’ultima identificata come nuovo interattore di pVHL30 in un lavoro parallelo non ancora pubblicato. Le diverse interazioni hanno evidenziato una tendenza isoforma-specifica, suggerendo per la porzione N-terminale un ruolo di regione discriminante nella scelta degli interattori. Esperimenti di microscopia confocale in cellule di mammifero mostrano inoltre una distribuzione diffusa di entrambe le isoforme, pVHL30 e pVHL172. Diversamente l’isoforma pVHL19 e il paralogo VLP, che mancano interamente (o parzialmente) della regione N-terminale, sono localizzate nel citosol in strutture definite punctate. Lo stesso viene osservato con il mutante tronco dell’isoforma VHL172 (pVHL172-ΔNT), evidenziando indirettamente che la localizzazione delle strutture VHL è regolata dalla regione N-terminale. Mediante frazionamento biochimico, è stato osservato che le isoforme caratterizzate dalla coda N-terminale completa, sono maggiormente presenti della frazione cellulare solubile. Al contrario, l’assenza della regione N-terminale aumenta marcatamente la presenza delle proteine nella frazione insolubile. Complessivamente, queste evidenze isoforma-specifiche suggeriscono un possibile ruolo funzionale distinto per ciascun membro della famiglia delle proteine VHL. In altre parole, queste strutture alternative di pVHL30 potrebbero essere frutto dell’evoluzione per sostenere funzioni tessuto-specifiche o competere per il legame con specifici partners. Entrambe le situazioni evidenziano ruoli biologici diversi al fine di regolare multiple o alternative vie di funzione nella cellula4. Alla luce di questi risultati significativi, è stato eseguito uno screening di libreria di cDNA tessuto-specifico in lievito per approfondire l’interattoma del paralogo VLP. Sono stati identificati e sequenziati 96 frammenti interagenti, ciascuno corrispondente ad una proteina diversa. Un’analisi computazionale preliminare ha rivelato che i partners di VLP sono principalmente localizzati nel nucleo e nel citosol, partecipando a tre principali funzioni cellulari (come regolazione dell'adesione extracellulare, rimodellamento del citoscheletro, nonché sopravvivenza e proliferazione cellulare). Inoltre, alcuni di questi interattori risultano caratterizzati da domini funzionali (come WD, LIM, ARM e zinc finger) comunemente presenti nelle proteine di scaffold, proponendo la possibile partecipazione di VLP in differenti complessi proteici. Più in generale, considerando la novità dei risultati ottenuti attraverso lo screening, la somiglianza strutturale con pVHL30 e l’espressione ubiquitaria di pVHL30, si può ipotizzare che queste nuove interazioni di VLP possano rappresentare un sottoinsieme di nuovi interattori di pVHL30. In altre parole, essi rappresentano un esempio di partner di pVHL30 tessuto-specifici. Sperimentalmente potrebbe essere possibile validare questa ipotesi eseguendo lo stesso screening utilizzando pVHL30 come esca (bait) del sistema doppio ibrido. D'altra parte, questo sottoinsieme di interattori specifici per VLP potrebbe essere frutto di un’evoluzione genica per rispondere alle esigenze specifiche del tessuto in questione. Se confermati, questi dati potrebbero aiutare a spiegare come l'alterazione funzionale della famiglia delle proteine VHL promuova l'insorgenza del cancro.