Skeletal muscle is an essential tissue for several vital functions. It displays an intrinsic regenerative ability in case of injury, thanks to the activation of satellite cells (SCs), the adult skeletal muscle stem cells. In presence of large defects, the renewing capacities of skeletal muscle are compromised. In such situations regenerative medicine may be a promising solution. This project is focused on a neonatal pathology known as congenital diaphragmatic hernia (CDH), in which the diaphragm fails to close during gestation. CDH is a severe anomaly with an incidence of 1 on 2,500-3,000 new-borns and high mortality rate. Currently, the most frequently used material for the surgical CDH repair is polytetrafluoroethylene (Gore-Tex[R]), but its application can lead to several drawbacks, as hernia recurrence and chest deformation. Great interest has been shown in alternative solutions based on tissue engineering approaches. In this regard, the use of decellularised extracellular matrix (ECM) revealed to be encouraging. When transplanted in vivo it can integrate with the native tissue, recruit host stem cells and influence their behaviour towards a regenerative process. The aim of this work is to characterise a novel tissue engineering approach based on the use of diaphragm decellularised ECM (dECM) as an alternative solution to the current CDH clinical options. The final purpose is to close the defect on the diaphragm and to induce its regeneration and functional recovery. In vivo, we created the first surgical CDH mouse model and we repaired the defect on the diaphragm using mouse dECM and expanded-polytetrafluoroethylene (ePTFE) as control. The transplantation of dECM patches did not cause any rejection effect nor hernia recurrence, differently from ePTFE treated mice. Moreover, ePTFE patches induced a foreign body reaction that was absent when dECM patches were used. We further considered three essential aspects of tissue regeneration: new muscle tissue formation, angiogenesis and re-innervation. In all the cases the biologic patch demonstrated to be better compared to ePTFE. The prolonged activation of muscle regeneration together with the angiogenic and re-innervation processes induced by dECM translated into an overall amelioration of diaphragmatic function compared to ePTFE-treated animals. Despite the positive clinical outcome, dECM patches did not activate complete regeneration of the defect. For this reason, we set up a tissue engineering technique to re-create in vitro diaphragmatic muscle tissues recellularising mouse diaphragm dECM and human MPCs cells. The aim was to obtain skeletal muscle-like substitutes for CDH capable to boost myofibers generation and further improve tissue functionality. We demonstrated that human MPCs not only were able to engraft the scaffold and repopulate the dECM in all its thickness, but most importantly, they differentiated giving rise to metabolic active myotubes. Moreover, a subpopulation of cells maintained SCs features, showing the ability to respond to in vitro injury. Given the positive outcomes obtained using dECM, the next step to get closer to clinic would be to use larger animal models. Moreover, the recellularisation could be improved by using mechanical stimulation, perfusion systems and by adding other cell types as endothelial and neural cells, in order to obtain a more complete in vitro construct for pre-clinical and clinical applications. Finally, the two parts of this project could be joined by closing the defect on the diaphragm using recellularised ECM, with the aim to favour tissue regeneration and reduce the drawbacks related to the use of current synthetic patches.

Il muscolo scheletrico ha un’intrinseca capacità rigenerativa grazie all’attività svolta dalle cellule satelliti. In presenza di danni estesi però tali capacità rigenerative possono essere compromesse. In queste situazioni un approccio di medicina rigenerativa può costituire una soluzione promettente. Questo progetto è focalizzato sull’ernia diaframmatica congenita, patologia neonatale caratterizzata da un’incompleta formazione del diaframma, con incidenza di 1 su 2,500-3,000 neonati e un alto tasso di mortalità. Attualmente, il materiale più usato per il riparo dell’ernia è il politetrafluoroetilene (Gore-Tex[R]), tuttavia il suo utilizzo può causare effetti collaterali, come la ricorrenza dell’ernia e malformazioni della cassa toracica. Grande interesse è stato rivolto a soluzioni di ingegneria tissutale, come l’uso di matrici extracellulari decellularizzate. Quando trapiantate in vivo esse riescono ad integrarsi in maniera fisiologica con il tessuto nativo e reclutano cellule staminali, modulando il loro comportamento verso un processo rigenerativo. Lo scopo di questo progetto è caratterizzare un approccio di ingegneria tissutale basato sull’uso di matrici decellularizzate come soluzione alternativa all’attuale metodo per il riparo l’ernia. L’obiettivo è chiudere il difetto sul diaframma ed indurne la rigenerazione. In vivo, abbiamo creato il primo modello murino di ernia diaframmatica e abbiamo riparato il difetto usando una matrice decellularizzata. Il politetrafluoroetilene espanso (ePTFE) è stato usato come controllo. Il trapianto di matrici decellularizzate non ha causato rigetto o ricorrenza dell’ernia, a differenza degli animali trattati con ePTFE. Inoltre, ePTFE ha indotto una reazione da corpo estraneo che era completamente assente negli animali trattati con la matrice biologica. Ci siamo poi concentrati su tre aspetti fondamentali della rigenerazione: la formazione di nuovo tessuto muscolare, angiogenesi e re-innervazione. In tutti i casi la matrice biologica ha dimostrato di essere migliore di quella sintetica. La prolungata attivazione della rigenerazione muscolare insieme ai processi angiogenici e di re-innervazione indotti dalla matrice extracellulare si sono tradotti in un generale miglioramento delle funzioni diaframmatiche rispetto a quanto ottenuto negli animali con ePTFE. Nonostante i risultati positivi, la matrice extracellulare non era in grado di indurre una completa rigenerazione del difetto. Perciò abbiamo messo a punto una tecnica di ingegneria tissutale per ricreare in vitro tessuti diaframmatici ricellularizzando matrici decellularizzate con precursori muscolari umani. Lo scopo era di ottenere dei possibili costrutti paragonabili al muscolo scheletrico da usare per il riapro dell’ernia in modo da stimolare maggiormente la generazione di nuove miofibre e migliorare la funzionalità tissutale. I precursori muscolari umani erano in grado di attecchire sulla matrice decellularizzata, di ripopolarla in tutto il suo spessore e di differenziare dando origine a miotubi attivi metabolicamente. Inoltre, una sottopopolazione di cellule manteneva le caratteristiche tipiche delle cellule satelliti, dimostrando di saper rispondere in vitro ad un danno. Visti i risultati positivi ottenuti usando la matrice decellularizzata, il passaggio successivo per avvicinarsi alla cinica è rappresentato dall’utilizzo di modelli animali più grandi. Inoltre, la ricellularizzazione potrebbe essere migliorata grazie a stimolazione meccanica, a sistemi di perfusione e all’aggiunta di altri tipi cellulari (cellule endoteliali e neurali) con lo scopo di ottenere un costrutto più completo per possibili applicazioni pre-cliniche e cliniche. Infine, le due parti di questo progetto potrebbero essere unite in futuro riparando il difetto sul diaframma usando matrici biologiche ricellularizzate al fine di favorire la rigenerazione e ridurre gli svantaggi legati all’uso delle matrici sintetiche.

Decellularised matrix and stem cells to rebuild damaged muscle: an innovative approach of regenerative medicine / Trevisan, Caterina. - (2018 Nov 28).

Decellularised matrix and stem cells to rebuild damaged muscle: an innovative approach of regenerative medicine

Trevisan, Caterina
2018

Abstract

Il muscolo scheletrico ha un’intrinseca capacità rigenerativa grazie all’attività svolta dalle cellule satelliti. In presenza di danni estesi però tali capacità rigenerative possono essere compromesse. In queste situazioni un approccio di medicina rigenerativa può costituire una soluzione promettente. Questo progetto è focalizzato sull’ernia diaframmatica congenita, patologia neonatale caratterizzata da un’incompleta formazione del diaframma, con incidenza di 1 su 2,500-3,000 neonati e un alto tasso di mortalità. Attualmente, il materiale più usato per il riparo dell’ernia è il politetrafluoroetilene (Gore-Tex[R]), tuttavia il suo utilizzo può causare effetti collaterali, come la ricorrenza dell’ernia e malformazioni della cassa toracica. Grande interesse è stato rivolto a soluzioni di ingegneria tissutale, come l’uso di matrici extracellulari decellularizzate. Quando trapiantate in vivo esse riescono ad integrarsi in maniera fisiologica con il tessuto nativo e reclutano cellule staminali, modulando il loro comportamento verso un processo rigenerativo. Lo scopo di questo progetto è caratterizzare un approccio di ingegneria tissutale basato sull’uso di matrici decellularizzate come soluzione alternativa all’attuale metodo per il riparo l’ernia. L’obiettivo è chiudere il difetto sul diaframma ed indurne la rigenerazione. In vivo, abbiamo creato il primo modello murino di ernia diaframmatica e abbiamo riparato il difetto usando una matrice decellularizzata. Il politetrafluoroetilene espanso (ePTFE) è stato usato come controllo. Il trapianto di matrici decellularizzate non ha causato rigetto o ricorrenza dell’ernia, a differenza degli animali trattati con ePTFE. Inoltre, ePTFE ha indotto una reazione da corpo estraneo che era completamente assente negli animali trattati con la matrice biologica. Ci siamo poi concentrati su tre aspetti fondamentali della rigenerazione: la formazione di nuovo tessuto muscolare, angiogenesi e re-innervazione. In tutti i casi la matrice biologica ha dimostrato di essere migliore di quella sintetica. La prolungata attivazione della rigenerazione muscolare insieme ai processi angiogenici e di re-innervazione indotti dalla matrice extracellulare si sono tradotti in un generale miglioramento delle funzioni diaframmatiche rispetto a quanto ottenuto negli animali con ePTFE. Nonostante i risultati positivi, la matrice extracellulare non era in grado di indurre una completa rigenerazione del difetto. Perciò abbiamo messo a punto una tecnica di ingegneria tissutale per ricreare in vitro tessuti diaframmatici ricellularizzando matrici decellularizzate con precursori muscolari umani. Lo scopo era di ottenere dei possibili costrutti paragonabili al muscolo scheletrico da usare per il riapro dell’ernia in modo da stimolare maggiormente la generazione di nuove miofibre e migliorare la funzionalità tissutale. I precursori muscolari umani erano in grado di attecchire sulla matrice decellularizzata, di ripopolarla in tutto il suo spessore e di differenziare dando origine a miotubi attivi metabolicamente. Inoltre, una sottopopolazione di cellule manteneva le caratteristiche tipiche delle cellule satelliti, dimostrando di saper rispondere in vitro ad un danno. Visti i risultati positivi ottenuti usando la matrice decellularizzata, il passaggio successivo per avvicinarsi alla cinica è rappresentato dall’utilizzo di modelli animali più grandi. Inoltre, la ricellularizzazione potrebbe essere migliorata grazie a stimolazione meccanica, a sistemi di perfusione e all’aggiunta di altri tipi cellulari (cellule endoteliali e neurali) con lo scopo di ottenere un costrutto più completo per possibili applicazioni pre-cliniche e cliniche. Infine, le due parti di questo progetto potrebbero essere unite in futuro riparando il difetto sul diaframma usando matrici biologiche ricellularizzate al fine di favorire la rigenerazione e ridurre gli svantaggi legati all’uso delle matrici sintetiche.
28-nov-2018
Skeletal muscle is an essential tissue for several vital functions. It displays an intrinsic regenerative ability in case of injury, thanks to the activation of satellite cells (SCs), the adult skeletal muscle stem cells. In presence of large defects, the renewing capacities of skeletal muscle are compromised. In such situations regenerative medicine may be a promising solution. This project is focused on a neonatal pathology known as congenital diaphragmatic hernia (CDH), in which the diaphragm fails to close during gestation. CDH is a severe anomaly with an incidence of 1 on 2,500-3,000 new-borns and high mortality rate. Currently, the most frequently used material for the surgical CDH repair is polytetrafluoroethylene (Gore-Tex[R]), but its application can lead to several drawbacks, as hernia recurrence and chest deformation. Great interest has been shown in alternative solutions based on tissue engineering approaches. In this regard, the use of decellularised extracellular matrix (ECM) revealed to be encouraging. When transplanted in vivo it can integrate with the native tissue, recruit host stem cells and influence their behaviour towards a regenerative process. The aim of this work is to characterise a novel tissue engineering approach based on the use of diaphragm decellularised ECM (dECM) as an alternative solution to the current CDH clinical options. The final purpose is to close the defect on the diaphragm and to induce its regeneration and functional recovery. In vivo, we created the first surgical CDH mouse model and we repaired the defect on the diaphragm using mouse dECM and expanded-polytetrafluoroethylene (ePTFE) as control. The transplantation of dECM patches did not cause any rejection effect nor hernia recurrence, differently from ePTFE treated mice. Moreover, ePTFE patches induced a foreign body reaction that was absent when dECM patches were used. We further considered three essential aspects of tissue regeneration: new muscle tissue formation, angiogenesis and re-innervation. In all the cases the biologic patch demonstrated to be better compared to ePTFE. The prolonged activation of muscle regeneration together with the angiogenic and re-innervation processes induced by dECM translated into an overall amelioration of diaphragmatic function compared to ePTFE-treated animals. Despite the positive clinical outcome, dECM patches did not activate complete regeneration of the defect. For this reason, we set up a tissue engineering technique to re-create in vitro diaphragmatic muscle tissues recellularising mouse diaphragm dECM and human MPCs cells. The aim was to obtain skeletal muscle-like substitutes for CDH capable to boost myofibers generation and further improve tissue functionality. We demonstrated that human MPCs not only were able to engraft the scaffold and repopulate the dECM in all its thickness, but most importantly, they differentiated giving rise to metabolic active myotubes. Moreover, a subpopulation of cells maintained SCs features, showing the ability to respond to in vitro injury. Given the positive outcomes obtained using dECM, the next step to get closer to clinic would be to use larger animal models. Moreover, the recellularisation could be improved by using mechanical stimulation, perfusion systems and by adding other cell types as endothelial and neural cells, in order to obtain a more complete in vitro construct for pre-clinical and clinical applications. Finally, the two parts of this project could be joined by closing the defect on the diaphragm using recellularised ECM, with the aim to favour tissue regeneration and reduce the drawbacks related to the use of current synthetic patches.
Skeletal muscle; tissue engineering; congenital diaphragmatic hernia; decellularisation; recellularisation; muscle stem cells; regenerative medicine; extracellular matrix
Decellularised matrix and stem cells to rebuild damaged muscle: an innovative approach of regenerative medicine / Trevisan, Caterina. - (2018 Nov 28).
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11577/3424881
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