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Tognon, Martina (2018) Investigation of Metabolic Heterogeneity and Clonal Selection Driven by anti-VEGF therapy in Ovarian Cancer. [Ph.D. thesis]

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Abstract (italian or english)

The process of neoplastic transformation is associated with profound metabolic changes, including the widely studied dysregulated glucose metabolism. It is also increasingly recognized that tumors are metabolically heterogeneous, including both inter- and intra-tumor metabolic heterogeneity. However, whether this phenomenon depends on the existence of sub-populations endowed with different metabolic features or, rather, local modulation of the metabolism associated with microenvironment factors, such as hypoxia, has less been investigated. Along this line, we recently reported that anti-VEGF therapy (Bevacizumab) induces a stable metabolic change in epithelial ovarian cancer (EOC) xenografts that correlates with resistance to anti-angiogenic therapy.
Aim of this Project is (I) to investigate whether metabolic heterogeneity exists at the clonal level in cancer cells; (II) to investigate the metabolic profile associated with this phenomenon and (III) establish whether anti-angiogenic therapy might shew tumor metabolism, leading to selection of metabolic variants poorly represented in the original tumor (IV) and whether it is possible to treat the resistant cell population with drugs targeting their key metabolic features.
To achieve these aims, we initially isolated by limiting dilution several (n=10-35) clones from established ovarian cancer cell lines previously characterized for their glycolytic activity. Indeed, IGROV-1 and SKOV3 cells are prototypes of poorly glycolytic cells, whereas OC316 cells are highly glycolytic cells. OAW42, A2780 and A2774 ovarian cancer cell lines showed an intermediate glycolytic profile compared to IGROV1 and OC316 cells, according to measurements of glucose consumption and lactate production in vitro.
We speculated that highly glycolytic cells could be relatively glucose addicted and hence tolerate less glucose starvation, compared with poorly glycolytic cells. To test this hypothesis, we cultivated clones either in the presence or in the absence of glucose (2 g/l) in the medium. Following 1-2 days in culture, clones were scored by optical microscopy. We used the acronym GDS to refer to a Glucose Deprivation Sensitive clone or GDR to indicate a clone relatively Resistant to Glucose Deprivation. Results showed that OC316-derived clones were exclusively of the GDS type, whereas IGROV-1 and SKOV3 cancer cell lines included both GDR (55%) and GDS (45%) clones. OAW42 cells were composed by 68% of GDR and 32% of GDS clones, A2780 and A2774 cells showed high enrichment in GDR clones.
The GDR/GDS phenotype was substantially stable when clones were analyzed over separate weeks. Moreover, GDS clones did not express higher levels of transcripts link with glycolysis pathway or elevate lactate production compared with GDR clones. We performed a Seahorse analysis and we observed that Oxigen Consumption Rate was higher in GDR compared to GDS clones. Metabolomic analysis showed that the majority of pathways differentially active in GDS versus GDR clones were linked to mitochondrial functions. Unexpectedly, we could not discriminate GDS clones for their glycolytic activity, but we noticed an altered mitochondria pathway in GDR group compared to GDS clones. We also evaluated the modulation of different pathways in GDR and GDS clones under glucose starvation.
Next, to investigate whether anti-angiogenic therapy would perturb the GDS/GDR ratio, we isolated GDS and GDR clones from ex vivo cultures of Control and Bevacizumab-treated IGROV-1 tumors. In the case of clones derived from Control tumors, the percentage of GDR and GDS clones was similar to that found in the parental IGROV-1 cell line. Cultures derived from Bevacizumab-treated tumors had an enrichment in GDR clones, suggesting that anti-VEGF therapy might perturb metabolic heterogeneity in tumors.

Abstract (a different language)

Il processo di trasformazione neoplastica è associato ad un profondo cambiamento metabolico che comprende anche l’ampiamente studiata modulazione del metabolismo del glucosio. È inoltre sempre più apprezzato il fatto che i tumori sono metabolicamente eterogenei, compresa l'eterogeneità metabolica intra- e inter-tumorale. Tuttavia, non è ancora stato ampiamente studiato se questo fenomeno dipenda dall’esistenza di sottopopolazioni tumorali dotate di caratteristiche metaboliche diverse oppure da modulazioni locali del metabolismo associato a fattori del microambiente, come per esempio l’ipossia. In base a queste osservazioni, abbiamo recentemente dimostrato che la terapia che prevede l’utilizzo di un anticorpo monoclonale anti-VEGF, Bevacizumab, induce un cambiamento metabolico stabile in xenotrapianti di cancro ovarico epiteliale che correla con un’aumentata aggressività tumorale e la resistenza alla terapia anti-angiogenica.
Lo scopo di questo progetto è quello di indagare se esiste eterogeneità a livello clonale in colture di cellule tumorali e di studiare l’aspetto metabolico associato a questo fenomeno. Abbiamo voluto stabilire se alcune terapie mirate possano modificare il metabolismo tumorale, grazie alla selezione di varianti metaboliche scarsamente rappresentate nel tumore originale e quando sia possibile, trattare queste cellule tumorali con un inibitore diverso dal Bevacizumab.
Per raggiungere questi obiettivi, abbiamo inizialmente isolato, usando diluizioni seriali, diversi cloni (n = 10-35) da linee cellulari di cancro ovarico, precedentemente caratterizzate per la loro attività glicolitica. Infatti, le cellule IGROV-1 e SKOV3 sono prototipi di cellule scarsamente glicolitiche, mentre le cellule OC316 sono altamente glicolitiche. Le linee cellulari di cancro ovarico OAW42, A2780 e A2774 hanno mostrato un profilo glicolitico intermedio rispetto alle cellule IGROV-1 e OC316, in accordo con le misure della produzione di lattato e del consumo del glucosio in vitro. Abbiamo ipotizzato che cellule altamente glicolitiche potrebbero essere relativamente dipendenti dal glucosio e quindi meno tolleranti se nel terreno di coltura manca questo nutriente, rispetto alle cellule scarsamente glicolitiche. Per verificare questa ipotesi, abbiamo coltivato i cloni in presenza o in assenza di glucosio (2 g/l) nel terreno di coltura.
Dopo 72h in cui i cloni sono stati sottoposti a deprivazione di glucosio, sono stati valutati attraverso la microscopia ottica. Abbiamo usato l'acronimo GDS per riferirci ad un clone sensibile alla deprivazione di glucosio e GDR per indicare un clone relativamente resistente alla deprivazione di glucosio. I risultati hanno mostrato che i cloni derivanti dalla coltura cellulare OC316 erano esclusivamente del tipo GDS, mentre nelle linee cellulari IGROV-1 e SKOV3 erano presenti entrambi i due sottogruppi di cloni GDR (55%) e cloni GDS (45%). La linea cellulare OAW42 era composta per il 68% da cloni GDR e per il 32% da cloni GDS, invece le linee A2780 e A2774 hanno mostrato un alto arricchimento nella % di cloni GDR. Il fenotipo GDR/GDS è sostanzialmente stabile anche dopo settimane di analisi. Inoltre, abbiamo osservato che i cloni GDS non esprimono livelli più elevati di trascritti collegati con la via glicolitica e neanche livelli più elevati di produzione di lattato rispetto ai cloni GDR. Abbiamo effettuato un'analisi con la metodica del Seahorse e abbiamo osservato che il tasso di consumo di ossigeno era aumentato nel gruppo dei GDR rispetto ai cloni GDS.
L'analisi metabolomica ha mostrato che la maggior parte delle vie diversamente regolate era legata alla funzione mitocondriale nei cloni GDR. Inaspettatamente, non abbiamo potuto discriminare i cloni GDS per la loro attività glicolitica ma abbiamo notato una possibile alterazione dell’attività mitocondriale nel gruppo dei cloni GDR rispetto ai cloni GDS. Abbiamo anche valutato la modulazione di diverse vie metaboliche nei cloni GDR e GDS in condizioni di deprivazione di glucosio. Successivamente, abbiamo isolato i cloni GDR e GDS da colture cellulari ex vivo derivanti da tumori IGROV-1 trattati con Bevacizumab o di controllo. Abbiamo indagato se la terapia anti-angiogenica porta ad un’alterazione del rapporto GDR/GDS. Nel caso dei tumori di controllo, la percentuale dei cloni GDR e GDS isolati, era simile a quella trovata nelle cellule parentali IGROV-1. Le colture cellulari derivate da tumori trattati con Bevacizumab hanno mostrato un arricchimento nel numero di cloni GDR. Questo può suggerire che la terapia anti-VEGF perturba l’eterogeneità metabolica tumorale.

EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Indraccolo, Stefano
Ph.D. course:Ciclo 31 > Corsi 31 > ONCOLOGIA CLINICA E SPERIMENTALE E IMMUNOLOGIA
Data di deposito della tesi:30 November 2018
Anno di Pubblicazione:2018
Key Words:ovarian cancer, cancer metabolism, cancer heterogeneity, clonal selection, anti-VEGF therapy
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/06 Oncologia medica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chirurgiche Oncologiche e Gastroenterologiche
Codice ID:11434
Depositato il:06 Nov 2019 12:09
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