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Canato, Elena (2018) Development of novel super stealth immunoliposomes for anticancer drug delivery. [Ph.D. thesis]

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Thesis not accessible until 30 September 2021 for intellectual property related reasons.
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Abstract (italian or english)

Nowadays, liposomes play an important role in the field of drug delivery since they are biocompatible and versatile carriers. Their surface modification with hydrophilic polymers, usually polyethylene glycol (PEG), confers “stealth” properties, thus avoiding the fast clearance by the reticuloendothelial system and thereby increasing their circulation half-life in vivo. In such way, passive accumulation in the tumor site, exploiting the enhanced vascular permeability and lack of lymphatic drainage (EPR effect [1]) typically found in tumor tissues, is favoured.
The present work aimed at formulating new Super Stealth Immunoliposomes (SSILs), which should be both stable in the bloodstream and able to reach selectively the tumor site. The enhanced stability was achieved by using PEG dendron molecules conjugated to 2 or 4 molecules of distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE) [2]. This allowed to increase the hydrophobic interactions with the phospholipid bilayer with respect to the classical PEG-single phospholipid derivatives, thus avoiding the polymer detachment. Active targeting, instead, was obtained by conjugation of these PEG dendron-lipids derivatives to a targeting moiety. In this case, the Fab’ (fragment, antigen-binding) derived from Trastuzumab is used to target with high affinity HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2), which is overexpressed on the surface of certain tumor cells. Doxorubicin, an antineoplastic drug commonly used in the treatment of a wide range of cancers (leukaemia, lymphoma, many types of carcinoma and soft tissue sarcomas), was chosen to be loaded into these nanocarriers. Since Doxyl®/Caelyx®, doxorubicin stealth liposomal formulation on the market, contains mPEG2kDa-DSPE, it was initially decided to formulate SSILs using as well PEG2kDa dendron-lipids derivatives. Preliminary in vitro and in vivo experiments on super stealth liposomes (SSLn, n=2 or 4 DSPE), including either 5% or 10% mol of mPEG2kda-(DSPE)n and formulated without the targeting ligand, evidenced a negative trend of stability with the increase of the hydrophobic anchor (PEG-DSPE > PEG-DSPE2 > PEG-DSPE4). This behavior was confirmed by in vivo pharmacokinetics since stealth liposomes (SL) presented a prolonged half-life (t½ ~22h) compared to super stealth liposomes (SSL2 t½ ~8h and SSL4 t½ ~7h), which were eliminated even faster from the bloodstream than naked liposomes (t½ ~10h). For this reason, it was decided to formulate super stealth immunoliposomes using a higher MW polymer, namely PEG 5kDa. mPEG5kDa-(DSPE)n and Boc-NH-PEG5kDa-(DSPE)n derivatives were successfully synthesized, purified and characterized by 1H NMR spectroscopy. The Fab’ fragment of Trastuzumab, chosen as targeting agent. Functionalization of NH2-PEG-phopsholipids derivatives with N-(ß-maleimidopropyloxy)succinimide ester (BMPS) provided the best yields of monoPEGylated Fab’- PEG5kDa-DSPE, Fab’-PEG5kDa-(DSPE)2 and PEG5kDa-(DSPE)4, as evidenced by SDS-PAGE analysis. Post-insertion of mPEG-lipid(s) derivatives or/and ligand-coupled PEG-lipid(s) derivatives into drug-loaded pre-formed naked liposomes either failed or caused aggregation of the liposomal vesicles. TEM analysis evidenced jagged and discontinuous surfaces, justifying the physical instability of the formulated vesicles.
Post-insertion of Fab’-PEG dendron-lipids derivatives on doxorubicin-loaded pre-formed stealth (SL) and super stealth liposomes (SSLn) to obtain the corresponding super stealth immunoliposomes (SSILn) provided stable and homogeneous SSIL2 (102.11 ± 3.68 nm) and SIL (128.23 ± 1.02 nm) with low polydispersity index (PdI <0.1). Post-insertion of ligand-coupled PEG-lipid(s) derivatives resulted in 79.8 µg Fab’/µmol HSPC for SIL and 23.63 µg Fab’/µmol HSPC for SSIL2. SSIL4 formulation evidenced problems of aggregation also with this post-insertion approach. In vitro stability studies over time revealed that after 2 months of incubation at 4°C and 25 °C all tested formulations were still stable and homogeneous (PdI <0.1), proving the stabilizing effect provided by PEG by steric hindrance. At 37°C, instead, all liposomal formulations started to aggregate after 14 days, showing also increased PdI (> 0.1). According to drug release experiments doxorubicin was efficiently entrapped inside the nanocarrier and drug leakage was not observed within the 16 h of incubation in all tested formulations. Preliminary in vitro cytotoxicity studies were performed on human breast ductal carcinoma cell line (BT-474) overexpressing HER-2, evidenced that SL-DXR could not reduce the cell viability below 50% after a 24 h-treatment with 10 µM DXR, whereas both SIL-DXR and SSIL2-DXR reduced cell viability to about 40% in the same experimental conditions. Preliminary IC50 calculation evidenced that, at the tested conditions, all the doxorubicin-loaded liposomal formulations possessed the same potency in inducing cell death, whereas small differences were observed taking into consideration the efficacy of each formulation (SL-DXR < SIL-DXR < SSIL2-DXR). Interestingly, SSIL2-DXR possessed the same efficacy of free doxorubicin. In vivo pharmacokinetic studies in rats evidenced the prolonged half-life of SSIL2 (t½ = 37.80 h) compare to SL (t½ = 10.77 h), confirming the stabilizing effect of PEG dendron-lipids derivatives over mPEG-DSPE. Accordingly, a reduction in the clearance rate of SSIL2 (~0.2 ml/h) was observed with respect to SL (~0.5 ml/h), resulting in increased bioavailability (AUC) and distribution volume (Vd), also compared to all the other tested formulations. In vivo organ toxicity evaluation after single dose administration of 2.5 mg/kg in DXR evidenced that the gene expression of the three pro-inflammatory cytokines interleukin β1 (IL-1β), interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor α (TNFα) was enhanced in rats treated with SL-DXR and SIL-DXR, especially in liver, spleen and heart tissues. Histological analyses performed on liver and spleen sections of rats treated with SL-DXR and SIL-DXR showed remarkable alterations (granulomatous lesions, apoptotic bodies, etc.), whereas those treated with free DXR and SSIL2-DXR resulted generally healthy. Heart, lungs and brain didn’t show any pathological alteration in all the groups of rats examined.
Overall, SSIL2 proved to be the best and safest formulation both in terms of pharmacokinetic profile, cytokines expression and histological analysis of RES organs, thus representing a promising system to improve conventional cancer therapy by enhancing drug delivery and antitumor efficacy.

Abstract (a different language)

Attualmente, i liposomi rivestono un ruolo importante nel campo del drug delivery per la loro biocompatibilità e versatilità. La modifica della superficie liposomiale con polimeri idrofilici, generalmente polietilenglicole (PEG), conferisce proprietà “stealth” consentendo di evitare la rapida eliminazione da parte del sistema reticoloendoteliale, aumentando così il tempo di emivita in vivo. In questo modo, è favorito l’accumulo passivo nel sito tumorale, sfruttando l’aumentata permeabilità vascolare e il ridotto drenaggio linfatico (effetto EPR [1]) tipici dei tessuti tumorali. Il presente lavoro è mirato alla formulazione di nuovi immunoliposomi super stealth (SSILs) dotati sia di maggiore stabilità nel circolo sanguigno sia di un targeting selettivo al sito tumorale. L’aumentata stabilità è stata ottenuta mediante l’uso di molecole di PEG dendrone coniugate a 2 o 4 molecole di distearoilfosfoetanolamina (DSPE) [2]. Questo ha consentito di aumentare le interazioni idrofobiche con il doppio strato fosfolipidico rispetto al classico derivato PEG-fosfolipide ed evitare il distacco del polimero durante il circolo ematico. Il targeting attivo, invece, è stato ottenuto mediante coniugazione di questi derivati PEG dendrone-lipidi ad un agente di targeting. In questo caso, il Fab’ (fragment, antigen-binding) del Trastuzumab che ha una elevata affinità verso il recettore HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2), sovraespresso sulla superficie di alcune cellule tumorali. La doxorubicina, agente antineoplastico comunemente utilizzato nel trattamento di una grande varietà di tumori (lucemie, linfomi, vari tipi di carcinoma e sarcomi), è stata scelta per essere incapsulata all’interno di questi nanocarriers. Dal momento che Doxyl®/Caelyx®, formulazione liposomiale stealth contenente doxorubicina presente in commercio, contiene mPEG2kDa-DSPE, è stato inizialmente deciso di formulare gli SSILs usando dei derivati PEG2kDa-dendrone-lipidi. Studi preliminari in vitro e in vivo effettuati su liposomi super stealth (SSLn, n=2 o 4 DSPE) contenenti il 5% o 10% mol di mPEG2kda-(DSPE)n e privi di agente di targeting, hanno evidenziato un trend negativo di stabilità all’aumentare dell’ancoraggio idrofobico (PEG-DSPE > PEG-DSPE2 > PEG-DSPE4). Questo comportamento è stato confermato dagli studi di farmacocinetica in vivo poiché i liposomi stealth (SL) presentavano un’emivita prolungata (t½ ~22h) rispetto ai liposomi super stealth (SSL2 t½ ~8h e SSL4 t½ ~7h), i quali venivano eliminati dal circolo sanguigno anche più rapidamente dei liposomi convenzionali (t½ ~10h). Per questo motivo è stato deciso di formulare gli immunoliposomi super stealth usando un polimero a maggior peso molecolare (PEG 5kDa).
I derivati mPEG5kDa-(DSPE)n e Boc-NH-PEG5kDa-(DSPE)n sono stati sintetizzati, purificati e caratterizzati con successo mediante spettroscopia 1H NMR. La funzionalizzazione dei derivati H2N-PEG-lipidi con il cross-linker BMPS (estere N-(ß-maleimidopropilossi)succinimide) ha fornito rese migliori ottenendo i monoPEGhilati Fab’-PEG5kDa-DSPE, Fab’-PEG5kDa-(DSPE)2 and PEG5kDa-(DSPE)4, come dimostrato dalla caratterizzazione mediante SDS-PAGE. La post-insertion dei derivati mPEG-(DSPE)n e/o Fab’-PEG-(DSPE)n in liposomi convenzionali preformati contenenti il farmaco non è avvenuta con successo o ha portato all’aggregazione delle vescicole liposomiali.
Le immagini acquisite mediante TEM hanno evidenziato superfici discontinue, motivando l’instabilità delle vescicole formulate. La post-insertion dei derivati Fab’-PEG dendrone-lipidi su liposomi stealth (SL) e super stealth (SSLn) preformati contenenti doxorubicina, per ottenere i corrispondenti immunoliposomi super stealth (SSILn), ha fornito formulazioni stabili ed omogenee di SSIL2 (102.11 ± 3.68 nm) e SIL (128.23 ± 1.02 nm) con basso indice di polidispersività (PdI <0.1). La post-insertion è risultata in 79.8 µg Fab’/µmol HSPC negli SIL e 23.63 µg Fab’/µmol HSPC negli SSIL2. La formulazione SSIL4 ha riportato problemi di aggregazione anche con quest’ultimo approccio di post-insertion. Studi di stabilità in vitro a lungo termine hanno evidenziato che le tutte le formulazioni testate erano stabili ed omogenee (PdI <0.1) dopo 2 mesi di incubazione a 4°C e 25°C, dimostrando l’effetto stabilizzante del PEG che previene l’aggregazione per ingombro sterico. Incubando a 37°C, invece, le formulazioni iniziavano ad aggregare dopo 14 giorni, mostrando anche un aumento della polidispersività (PdI >0.1). Studi di rilascio in vitro hanno confermato che tutte le formulazioni testate sono in grado di trattenere efficacemente la doxorubicina incapsulata, la quale non viene rilasciata durante le 16 ore di incubazione. Studi preliminari in vitro di citotossicità, eseguiti su cellule umane di carcinoma mammario (BT-474) che sovraesprimono HER-2, hanno dimostrato che SL-DXR non sono in grado di ridurre la vitalità cellulare al di sotto del 50% dopo un trattamento di 24 ore con DXR 10 µM, mentre risulta ridotta al 40% dopo trattamento con SIL-DXR e SSIL2-DXR nelle stesse condizioni sperimentali. Un calcolo preliminare dell’IC50 ha dimostrato che tutte le formulazioni liposomiali possiedono la stessa potenza nell’indurre la morte cellulare, mentre minime differenze sono state osservate prendendo in considerazione l’efficacia di ciascuna formulazione (SL-DXR < SIL-DXR < SSIL2-DXR). È interessante notare che SSIL2-DXR dimostrano la stessa efficacia della DXR libera. Studi di farmacocinetica in vivo hanno evidenziato la prolungata emivita di SSIL2 (t½ = 37.80 h), confermando l’effetto stabilizzante dei derivati PEG dendrone-lipidi rispetto a mPEG-DSPE. Di conseguenza, una riduzione della clearance plasmatica di SSIL2 (~0.2 ml/h) è stata osservata rispetto a SL (~0.5 ml/h), con aumento della biodisponibilità (AUC) e del volume di biodistribuzione (Vd) rispetto alle altre formulazioni testate. La valutazione della tossicità d’organo in vivo dopo una singola somministrazione di 2.5 mg/kg in DXR ha messo in evidenza che l’espressione genica delle tre citochine proinfiammatorie interleukina β1 (IL-1β), interleukina 6 (IL-6) e tumor necrosis factor α (TNFα) è aumentata nei ratti trattati con SL-DXR e SIL-DXR, specialmente nel fegato, nella milza e nel cuore. L’analisi istologica effettuata su sezioni di tessuto di fegato e milza di ratti trattati con SL-DXR e SIL-DXR ha dimostrato la presenza di notevoli alterazioni patologiche (lesioni granulomatose, corpi apoptotici, ecc), mentre gli organi dei ratti trattati con DXR e SSIL2-DXR sono risultati complessivamente sani. Nel cuore, nei polmoni e nel cervello non è stata evidenziata alcuna alterazione patologica in tutti i gruppi di animali esaminati.
In generale, SSIL2 sono emersi come la formulazione migliore e più sicura in termini di profilo farmacocinetico, espressione di citochine infiammatorie e analisi istologica degli organi del sistema reticolo endoteliale (RES), rappresentando perciò un promettente sistema per migliorare il veicolamento di farmaci antitumorali convenzionali.

EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Pasut, Gianfranco
Ph.D. course:Ciclo 31 > Corsi 31 > SCIENZE MOLECOLARI
Data di deposito della tesi:29 November 2018
Anno di Pubblicazione:30 September 2018
Key Words:drug delivery, liposomes, immunoliposomes, super stealth, trastuzumab, doxorubicin, anticancer
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/09 Farmaceutico tecnologico applicativo
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze del Farmaco
Codice ID:11459
Depositato il:07 Nov 2019 11:57
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