T Large granular lymphocytes leukemia (T-LGLL) is a rare lymphoproliferative disorder characterized by the clonal expansion of T-LGL. According to the expression on the leukemic clone of CD8- (CD8+ T-LGLL) and CD4-related determinants (CD4+ T-LGLL) two main groups of patients are identified. Somatic mutations are involved in T-LGLL pathogenesis; they have been identified in genes that are central for the survival of the leukemic clone and are differently distributed among the patients. STAT3 mutations characterize CD8+ T-LGLL cases with a discrete immunophenotype (i.e. CD16+/CD56-) and correlate with neutropenia, which represents the most relevant clinical manifestation in T-LGLL. On the other hand, STAT5b mutations can be observed in CD4+ patients, usually characterized by an indolent disease. The leukemic clone survival is mediated by several deregulated pathways that are likely under the control of external stimuli. Indeed, several pro-inflammatory cytokines are increased in patients’ plasma, including CCL5 and IL-6. This latter cytokine has been demonstrated to sustain LGL survival via STAT3 activation. The role of soluble factors have been described in the pathogenesis of T-LGLL, but no data are up to now available on the cellular compartment of the microenvironment. For this reason we studied the involvement of tumour microenvironment (TME) cells and we found that: a) monocytes are central for leukemic LGL survival; b) leukemic cells belonging to CD8+ and CD4+ T-LGLL patients take advantage from different TME-mediated survival mechanisms. In CD8+ patients, particularly in cases with severe neutropenia, monocytes were altered in their population distribution, with an increase of intermediate and non-classical monocytes; in addition Th17/Treg ratio was found to be higher than in healthy controls, due to an increased Th17 cells percentage. Since these two features were associated with a high pro-inflammatory stimulus and correlated with the presence of concurrent autoimmune diseases, which are often reported in T-LGLL, we suggest that a strong peripheral blood inflammation is ongoing in CD8+ neutropenic patients. All these data taking together, we propose that a network takes place between LGL, monocytes and Th17 cells in CD8+ neutropenic patients. In detail, we identified that the CCL5 produced by the leukemic clone specifically stimulates the expression of IL-6 in monocytes, a cytokine that in turn is mandatory for the survival of the leukemic clone and for Th17 cells differentiation. We also reported that the above described alterations of cell subsets were partially reverted after immunosuppressive therapy, suggesting a putative role of these drugs as TME modifiers. A pro-inflammatory environment with different features was present in CD4+-LGLL patients, who were characterized by an indolent course of the disease. Similarly to CD8+ patients, they expressed a high Th17/Treg ratio, but the imbalance in this setting is sustained by a reduction of Treg cells. CD4+ LGLL patients were also found to be characterized by a peculiar over-activation of Erk in monocytes, which was reported to be indicative of Senescence Associated Secretory Phenotype (SASP), mostly composed of pro-inflammatory cytokines. Our data obtained through cytokines arrays demonstrated an overall higher level of plasma soluble factors in CD4+ patients than healthy controls, in particular soluble CD14 and Lymphotactin, which could account for TME cellular imbalances of these cases. This study emphasizes the role of inflammatory background occurring in the TME of T-LGLL patients pointing to newly reported differences between T-LGLL sub-types. In particular in symptomatic patients, we identified a putative network between TME cells and leukemic LGL, which could help defining new targets to design innovative strategies.

La leucemia a grandi linfociti granulati di tipo T (T-LGLL) è un raro disordine linfoproliferativo, caratterizzato da un’espansione clonale di T-LGL. Due gruppi principali di malattia sono individuabili in base all’immunofenotipo del clone leucemico; in particolare, si diversificano per l’espressione dell’antigene CD8 (CD8+ T-LGLL) o CD4 (CD4+ T-LGLL). Mutazioni somatiche sono coinvolte nella patogenesi della malattia, in quanto tali geni mutati son stati dimostrati essere importanti per la sopravvivenza del clone leucemico e si distribuiscono in modo differente fra pazienti. Le mutazioni del gene STAT3 caratterizzano i casi CD8+ T-LGLL con un particolare immunofenotipo (i.e. CD16+/CD56-) e correlano con l’incidenza di neutropenia, la quale è la più frequente manifestazione clinica della malattia. Le mutazioni nel gene STAT5b, invece, sono state osservate nei pazienti affetti da CD4+ T-LGLL, la quale, solitamente, ha un decorso indolente. Inoltre, la sopravvivenza del clone leucemico è mediata da pathway intracellulari deregolati, i quali sono ulteriormente stimolati dal microambiente tumorale. Infatti, molte citochine pro-infiammatorie sono state descritte presenti a concentrazioni maggiori nel plasma dei pazienti, rispetto ai controlli sani, come CCL5 e IL-6. In particolare, è stato dimostrato che IL-6 sostiene la sopravvivenza del clone tramite l’attivazione della proteina STAT3. Lo stato dell’arte sul ruolo del microambiente tumorale sulla patogenesi della T-LGLL, nel sangue periferico, principalmente si basa sul ruolo di fattori solubili, ma non sono ancora disponibili dati riguardanti il ruolo di altre cellule del sistema immunitario. Per tale motivo, in questo elaborato di tesi, è stato descritto il coinvolgimento delle cellule del microambiente nella patogenesi della T-LGLL ed è stato identificato che: a) monociti sono risultati essere centrali per la sopravvivenza dei T-LGL leucemici; b) pazienti affetti da CD8+ o CD4+ T-LGLL sono caratterizzati da diversi meccanismi di sopravvivenza mediata dal microambiente. Per i pazienti CD8+, in particolare per i casi con neutropenia severa, la distribuzione delle popolazioni monocitarie è risultata essere alterata, con un incremento dei monociti intermedi e non classici; inoltre anche il rapporto Th17/Treg è sbilanciato, in quanto la percentuale dei linfociti Th17 è aumentata rispetto ai controlli sani. Entrambi i fenomeni descritti sono associati ad un alto stimolo pro-infiammatorio e correlano, inoltre, con malattie autoimmuni, le quali spesso si associano alla T-LGLL. Per tali motivi è stato ipotizzato che i pazienti affetti da CD8+ T-LGLL, manifestanti neutropenia, siano caratterizzati da una forte infiammazione nel sangue periferico. Riassumendo, è stato possibile per cui proporre una rete di comunicazione fra T-LGL leucemici, monociti e linfociti Th17. In particolare, CCL5, chemochina prodotta dal clone leucemico, stimola in modo specifico l’espressione di IL-6 nei monociti dei pazienti, la quale, a sua volta, è necessaria per la sopravvivenza del clone e per il differenziamento dei linfociti Th17. Inoltre, lo studio ha dimostrato che gli sbilanciamenti descritti erano parzialmente tornati a livelli fisiologici, dopo che i pazienti avevano terminato il ciclo di terapia con immunosoppressori, descrivendo un possibile ruolo di questi come modificatori del microambiente tumorale. Anche i pazienti CD4+ sono caratterizzati da un particolare ambiente pro-infiammatorio, nonostante manifestino solitamente un decorso indolente. In particolare, similmente ai pazienti CD8+, il loro rapporto Th17/Treg è aumentato rispetto ai controlli sani, ma lo sbilanciamento, in questo, caso è sostenuto da una riduzione dei linfociti Treg. Anche i monociti sono risultati alterati dal loro stato fisiologico; infatti riportavano una maggiore attivazione della proteina Erk, la quale è stata descritta come indicativa di senescenza cellulare, inducendo, per cui, un particolare secretoma pro-infiammatorio in queste cellule, definito con l’acronimo SASP. Dati preliminari ottenuti da analisi di arrays di citochine hanno dimostrato un’incrementata secrezione di citochine nei pazienti CD4+ rispetto ai controlli sani, in particolare la forma solubile della proteina CD14 e Lynfotactina, le quali potrebbero spiegare le alterazioni delle cellule del microambiente descritte. In conclusione, questo studio ha descritto per la prima vota il ruolo delle cellule del microambiente e la loro differenza nello stimolo pro-infiammatorio, evidenziando ulteriormente le differenze fra tipologie di T-LGLL. In particolare, per i pazienti sintomatici, è stato ipotizzato un network di comunicazione fra cellule del microambiente e clone leucemico, dal quale potrebbe essere possibile individuare nuovi target terapeutici.

Dissection of the microenvironment role in T-large granular lymphocite leukemia / Vicenzetto, Cristina. - (2019 Nov 30).

Dissection of the microenvironment role in T-large granular lymphocite leukemia

Vicenzetto, Cristina
2019

Abstract

La leucemia a grandi linfociti granulati di tipo T (T-LGLL) è un raro disordine linfoproliferativo, caratterizzato da un’espansione clonale di T-LGL. Due gruppi principali di malattia sono individuabili in base all’immunofenotipo del clone leucemico; in particolare, si diversificano per l’espressione dell’antigene CD8 (CD8+ T-LGLL) o CD4 (CD4+ T-LGLL). Mutazioni somatiche sono coinvolte nella patogenesi della malattia, in quanto tali geni mutati son stati dimostrati essere importanti per la sopravvivenza del clone leucemico e si distribuiscono in modo differente fra pazienti. Le mutazioni del gene STAT3 caratterizzano i casi CD8+ T-LGLL con un particolare immunofenotipo (i.e. CD16+/CD56-) e correlano con l’incidenza di neutropenia, la quale è la più frequente manifestazione clinica della malattia. Le mutazioni nel gene STAT5b, invece, sono state osservate nei pazienti affetti da CD4+ T-LGLL, la quale, solitamente, ha un decorso indolente. Inoltre, la sopravvivenza del clone leucemico è mediata da pathway intracellulari deregolati, i quali sono ulteriormente stimolati dal microambiente tumorale. Infatti, molte citochine pro-infiammatorie sono state descritte presenti a concentrazioni maggiori nel plasma dei pazienti, rispetto ai controlli sani, come CCL5 e IL-6. In particolare, è stato dimostrato che IL-6 sostiene la sopravvivenza del clone tramite l’attivazione della proteina STAT3. Lo stato dell’arte sul ruolo del microambiente tumorale sulla patogenesi della T-LGLL, nel sangue periferico, principalmente si basa sul ruolo di fattori solubili, ma non sono ancora disponibili dati riguardanti il ruolo di altre cellule del sistema immunitario. Per tale motivo, in questo elaborato di tesi, è stato descritto il coinvolgimento delle cellule del microambiente nella patogenesi della T-LGLL ed è stato identificato che: a) monociti sono risultati essere centrali per la sopravvivenza dei T-LGL leucemici; b) pazienti affetti da CD8+ o CD4+ T-LGLL sono caratterizzati da diversi meccanismi di sopravvivenza mediata dal microambiente. Per i pazienti CD8+, in particolare per i casi con neutropenia severa, la distribuzione delle popolazioni monocitarie è risultata essere alterata, con un incremento dei monociti intermedi e non classici; inoltre anche il rapporto Th17/Treg è sbilanciato, in quanto la percentuale dei linfociti Th17 è aumentata rispetto ai controlli sani. Entrambi i fenomeni descritti sono associati ad un alto stimolo pro-infiammatorio e correlano, inoltre, con malattie autoimmuni, le quali spesso si associano alla T-LGLL. Per tali motivi è stato ipotizzato che i pazienti affetti da CD8+ T-LGLL, manifestanti neutropenia, siano caratterizzati da una forte infiammazione nel sangue periferico. Riassumendo, è stato possibile per cui proporre una rete di comunicazione fra T-LGL leucemici, monociti e linfociti Th17. In particolare, CCL5, chemochina prodotta dal clone leucemico, stimola in modo specifico l’espressione di IL-6 nei monociti dei pazienti, la quale, a sua volta, è necessaria per la sopravvivenza del clone e per il differenziamento dei linfociti Th17. Inoltre, lo studio ha dimostrato che gli sbilanciamenti descritti erano parzialmente tornati a livelli fisiologici, dopo che i pazienti avevano terminato il ciclo di terapia con immunosoppressori, descrivendo un possibile ruolo di questi come modificatori del microambiente tumorale. Anche i pazienti CD4+ sono caratterizzati da un particolare ambiente pro-infiammatorio, nonostante manifestino solitamente un decorso indolente. In particolare, similmente ai pazienti CD8+, il loro rapporto Th17/Treg è aumentato rispetto ai controlli sani, ma lo sbilanciamento, in questo, caso è sostenuto da una riduzione dei linfociti Treg. Anche i monociti sono risultati alterati dal loro stato fisiologico; infatti riportavano una maggiore attivazione della proteina Erk, la quale è stata descritta come indicativa di senescenza cellulare, inducendo, per cui, un particolare secretoma pro-infiammatorio in queste cellule, definito con l’acronimo SASP. Dati preliminari ottenuti da analisi di arrays di citochine hanno dimostrato un’incrementata secrezione di citochine nei pazienti CD4+ rispetto ai controlli sani, in particolare la forma solubile della proteina CD14 e Lynfotactina, le quali potrebbero spiegare le alterazioni delle cellule del microambiente descritte. In conclusione, questo studio ha descritto per la prima vota il ruolo delle cellule del microambiente e la loro differenza nello stimolo pro-infiammatorio, evidenziando ulteriormente le differenze fra tipologie di T-LGLL. In particolare, per i pazienti sintomatici, è stato ipotizzato un network di comunicazione fra cellule del microambiente e clone leucemico, dal quale potrebbe essere possibile individuare nuovi target terapeutici.
30-nov-2019
T Large granular lymphocytes leukemia (T-LGLL) is a rare lymphoproliferative disorder characterized by the clonal expansion of T-LGL. According to the expression on the leukemic clone of CD8- (CD8+ T-LGLL) and CD4-related determinants (CD4+ T-LGLL) two main groups of patients are identified. Somatic mutations are involved in T-LGLL pathogenesis; they have been identified in genes that are central for the survival of the leukemic clone and are differently distributed among the patients. STAT3 mutations characterize CD8+ T-LGLL cases with a discrete immunophenotype (i.e. CD16+/CD56-) and correlate with neutropenia, which represents the most relevant clinical manifestation in T-LGLL. On the other hand, STAT5b mutations can be observed in CD4+ patients, usually characterized by an indolent disease. The leukemic clone survival is mediated by several deregulated pathways that are likely under the control of external stimuli. Indeed, several pro-inflammatory cytokines are increased in patients’ plasma, including CCL5 and IL-6. This latter cytokine has been demonstrated to sustain LGL survival via STAT3 activation. The role of soluble factors have been described in the pathogenesis of T-LGLL, but no data are up to now available on the cellular compartment of the microenvironment. For this reason we studied the involvement of tumour microenvironment (TME) cells and we found that: a) monocytes are central for leukemic LGL survival; b) leukemic cells belonging to CD8+ and CD4+ T-LGLL patients take advantage from different TME-mediated survival mechanisms. In CD8+ patients, particularly in cases with severe neutropenia, monocytes were altered in their population distribution, with an increase of intermediate and non-classical monocytes; in addition Th17/Treg ratio was found to be higher than in healthy controls, due to an increased Th17 cells percentage. Since these two features were associated with a high pro-inflammatory stimulus and correlated with the presence of concurrent autoimmune diseases, which are often reported in T-LGLL, we suggest that a strong peripheral blood inflammation is ongoing in CD8+ neutropenic patients. All these data taking together, we propose that a network takes place between LGL, monocytes and Th17 cells in CD8+ neutropenic patients. In detail, we identified that the CCL5 produced by the leukemic clone specifically stimulates the expression of IL-6 in monocytes, a cytokine that in turn is mandatory for the survival of the leukemic clone and for Th17 cells differentiation. We also reported that the above described alterations of cell subsets were partially reverted after immunosuppressive therapy, suggesting a putative role of these drugs as TME modifiers. A pro-inflammatory environment with different features was present in CD4+-LGLL patients, who were characterized by an indolent course of the disease. Similarly to CD8+ patients, they expressed a high Th17/Treg ratio, but the imbalance in this setting is sustained by a reduction of Treg cells. CD4+ LGLL patients were also found to be characterized by a peculiar over-activation of Erk in monocytes, which was reported to be indicative of Senescence Associated Secretory Phenotype (SASP), mostly composed of pro-inflammatory cytokines. Our data obtained through cytokines arrays demonstrated an overall higher level of plasma soluble factors in CD4+ patients than healthy controls, in particular soluble CD14 and Lymphotactin, which could account for TME cellular imbalances of these cases. This study emphasizes the role of inflammatory background occurring in the TME of T-LGLL patients pointing to newly reported differences between T-LGLL sub-types. In particular in symptomatic patients, we identified a putative network between TME cells and leukemic LGL, which could help defining new targets to design innovative strategies.
T-LGLL, leukemia, microenvironment, inflammation, cytokines, monocytes, Th17
Dissection of the microenvironment role in T-large granular lymphocite leukemia / Vicenzetto, Cristina. - (2019 Nov 30).
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