Recently, engineered tissues have found an alternative application as in vitro models. They will never be implanted directly into patients, but will instead be used to transform the way we study human tissue physiology and pathophysiology in vitro. The development of new drugs and therapies for diseases such as Duchenne Muscular Dystrophy or myocardium failure is greatly slowed and hindered by the lack of adequate in vitro models, which should be functional, representative of human tissue, easy to use and economic. Therefore the requirements are the use of a human cell source; working at the microscale, in order to reproduce with high precision the cell microenvironment and to guide cell differentiation correctly. The microscale gives the additional possibility of developing micrometric array of cells which can be coupled to microfluidic platforms for highthroughput experiments, which are fundamental for multifactorial diseases such as DMD and HF. Moreover the use of easy methodologies and simple techniques allowed the use of the model by researchers with different background and skills. In this scenario, the aim of this thesis is the obtainment of human functional skeletal and cardiac tissues, through the application of innovative microscale techniques to standard cell culture devices. The strategy employed is biomimetic and multidisciplinary: the cell culture microenvironment has been engineered in order to reproduce in vitro the major stimuli that guide muscle cell differentiation in vivo. The coupling of tools and methodologies of the tissue engineering with innovative microscale technologies developed by engineers of the laboratory has led to a precise control of the cell microenvironment. In particular, the chemical-physical properties of the substrates, the topologic organization of cells and the application of exogenous electrical stimuli were optimized during this work. The developed devices were used with cell culture of particular interest, such as human primary dystrophic myoblasts and human embryonic stem cells (hESC). The functional analysis of the obtained skeletal muscle tissue, both dystrophic and healthy, highlighted a more rapid differentiation process of myoblasts cultured with the innovative techniques in comparison to standard cell culture systems. Electrical stimulation was applied to hESC in order to favor the cardiac differentiation pathway and an array of human beating cardiomyocytes has been developed.Taken together these results open new promising prospective for the development of in vitro model for preclinical trials of drugs or therapies for the treatment of pathologies of skeletal and cardiac muscles.

L’utilizzo di tessuti ingegnerizzati come modelli in vitro è recentemente emerso come applicazione alternativa al loro tradizionale impianto in vivo. Lo sviluppo di nuovi farmaci e terapie, nel caso di malattie quali la Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) o l’infarto miocardico (HF), sono infatti fortemente limitati e rallentati della mancanza di adeguati modelli in vitro: rappresentativi del tessuto umano e delle sue proprietà funzionali, di semplice utilizzo ed accessibili economicamente. Prerequisiti necessari all’ottenimento di un modello che risponda a tali esigenze sono: l’utilizzo di una fonte cellulare umana primaria; l’impiego di tecniche micrometriche, in primo luogo per il fine controllo del microambiente e del conseguente differenziamento cellulare in tessuto funzionale e per la riduzione dei costi di ricerca. Lo sviluppo su microscala permette inoltre di effettuare sperimentazioni multiparametriche, essenziali per patologie multifattoriali quali DMD e HF, con un elevato numero di dati in uscita. Infine, l’utilizzo di metodologie e tecniche semplici permette il trasferimento tra laboratori e ricercatori di diversa formazione. Lo scopo di questa tesi è stato quindi l’ottenimento di tessuti umani funzionali di muscolo scheletrico e cardiaco mediante l’utilizzo di tecniche di microscala, al fine di soddisfare le attuali esigenze di ricerca. È stato utilizzato un approccio biomimetico e multidisciplinare: un’accurata ingegnerizzazione del microambiente cellulare ha permesso di riprodurre in vitro i principali stimoli che in vivo guidano la differenziazione cellulare, così da ottenere un tessuto funzionale e rappresentativo del tessuto naturale. Le metodologie classiche dell’ingegneria dei tessuti sono state accoppiate ad innovative tecnologie di microscala, precedentemente sviluppate dagli ingegneri del laboratorio, per il preciso controllo dell’ambiente cellulare a livello micrometrico. In particolare sono state ottimizzate le proprietà chimico-fisiche del substrato, l’organizzazione topologica delle colture e l’applicazione di stimolazione elettrica esogena. Tali sistemi sono stati utilizzati con colture di particolare interesse quali mioblasti umani distrofici e cellule staminali embrionali umane (hESC). L’analisi funzionale del tessuto scheletrico umano così ottenuto, sia distrofico che sano, ha evidenziato come i sistemi sviluppati siano in grado di indurre un processo differenziativo più rapido rispetto ai tradizionali metodi di coltura. È stato valutato l’effetto di stimolazioni elettriche esogene sul differenziamento cardiomiocitario di hESC ed è stato sviluppato un array di cardiomiociti umani contrattili. Tali risultati aprono promettenti prospettive per lo sviluppo di modelli in vitro che permettano lo screening preclinico di nuovi farmaci o nuove terapie per la cura delle patologie a carico della muscolatura scheletrica e cardiaca.

Microscale Tissue Engineering of human skeletal and cardiac muscles for in vitro applications / Serena, Elena. - (2009 Feb 01).

Microscale Tissue Engineering of human skeletal and cardiac muscles for in vitro applications

Serena, Elena
2009

Abstract

L’utilizzo di tessuti ingegnerizzati come modelli in vitro è recentemente emerso come applicazione alternativa al loro tradizionale impianto in vivo. Lo sviluppo di nuovi farmaci e terapie, nel caso di malattie quali la Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) o l’infarto miocardico (HF), sono infatti fortemente limitati e rallentati della mancanza di adeguati modelli in vitro: rappresentativi del tessuto umano e delle sue proprietà funzionali, di semplice utilizzo ed accessibili economicamente. Prerequisiti necessari all’ottenimento di un modello che risponda a tali esigenze sono: l’utilizzo di una fonte cellulare umana primaria; l’impiego di tecniche micrometriche, in primo luogo per il fine controllo del microambiente e del conseguente differenziamento cellulare in tessuto funzionale e per la riduzione dei costi di ricerca. Lo sviluppo su microscala permette inoltre di effettuare sperimentazioni multiparametriche, essenziali per patologie multifattoriali quali DMD e HF, con un elevato numero di dati in uscita. Infine, l’utilizzo di metodologie e tecniche semplici permette il trasferimento tra laboratori e ricercatori di diversa formazione. Lo scopo di questa tesi è stato quindi l’ottenimento di tessuti umani funzionali di muscolo scheletrico e cardiaco mediante l’utilizzo di tecniche di microscala, al fine di soddisfare le attuali esigenze di ricerca. È stato utilizzato un approccio biomimetico e multidisciplinare: un’accurata ingegnerizzazione del microambiente cellulare ha permesso di riprodurre in vitro i principali stimoli che in vivo guidano la differenziazione cellulare, così da ottenere un tessuto funzionale e rappresentativo del tessuto naturale. Le metodologie classiche dell’ingegneria dei tessuti sono state accoppiate ad innovative tecnologie di microscala, precedentemente sviluppate dagli ingegneri del laboratorio, per il preciso controllo dell’ambiente cellulare a livello micrometrico. In particolare sono state ottimizzate le proprietà chimico-fisiche del substrato, l’organizzazione topologica delle colture e l’applicazione di stimolazione elettrica esogena. Tali sistemi sono stati utilizzati con colture di particolare interesse quali mioblasti umani distrofici e cellule staminali embrionali umane (hESC). L’analisi funzionale del tessuto scheletrico umano così ottenuto, sia distrofico che sano, ha evidenziato come i sistemi sviluppati siano in grado di indurre un processo differenziativo più rapido rispetto ai tradizionali metodi di coltura. È stato valutato l’effetto di stimolazioni elettriche esogene sul differenziamento cardiomiocitario di hESC ed è stato sviluppato un array di cardiomiociti umani contrattili. Tali risultati aprono promettenti prospettive per lo sviluppo di modelli in vitro che permettano lo screening preclinico di nuovi farmaci o nuove terapie per la cura delle patologie a carico della muscolatura scheletrica e cardiaca.
1-feb-2009
Recently, engineered tissues have found an alternative application as in vitro models. They will never be implanted directly into patients, but will instead be used to transform the way we study human tissue physiology and pathophysiology in vitro. The development of new drugs and therapies for diseases such as Duchenne Muscular Dystrophy or myocardium failure is greatly slowed and hindered by the lack of adequate in vitro models, which should be functional, representative of human tissue, easy to use and economic. Therefore the requirements are the use of a human cell source; working at the microscale, in order to reproduce with high precision the cell microenvironment and to guide cell differentiation correctly. The microscale gives the additional possibility of developing micrometric array of cells which can be coupled to microfluidic platforms for highthroughput experiments, which are fundamental for multifactorial diseases such as DMD and HF. Moreover the use of easy methodologies and simple techniques allowed the use of the model by researchers with different background and skills. In this scenario, the aim of this thesis is the obtainment of human functional skeletal and cardiac tissues, through the application of innovative microscale techniques to standard cell culture devices. The strategy employed is biomimetic and multidisciplinary: the cell culture microenvironment has been engineered in order to reproduce in vitro the major stimuli that guide muscle cell differentiation in vivo. The coupling of tools and methodologies of the tissue engineering with innovative microscale technologies developed by engineers of the laboratory has led to a precise control of the cell microenvironment. In particular, the chemical-physical properties of the substrates, the topologic organization of cells and the application of exogenous electrical stimuli were optimized during this work. The developed devices were used with cell culture of particular interest, such as human primary dystrophic myoblasts and human embryonic stem cells (hESC). The functional analysis of the obtained skeletal muscle tissue, both dystrophic and healthy, highlighted a more rapid differentiation process of myoblasts cultured with the innovative techniques in comparison to standard cell culture systems. Electrical stimulation was applied to hESC in order to favor the cardiac differentiation pathway and an array of human beating cardiomyocytes has been developed.Taken together these results open new promising prospective for the development of in vitro model for preclinical trials of drugs or therapies for the treatment of pathologies of skeletal and cardiac muscles.
skeletal muscle tissue engineering, cardiac tissue engineering, human embryonic stem cell, Duchenne Muscular Dystrophy, microscale technologies, in vitro model, biomaterials, bioreactors
Microscale Tissue Engineering of human skeletal and cardiac muscles for in vitro applications / Serena, Elena. - (2009 Feb 01).
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