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Comin, Alessandra (2009) Ruolo delle proteine del tegumento nelle interazioni tra il virus dell’Herpes simplex di tipo1 e il pathway dei Multivesicular bodies. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Many enveloped viruses complete their replication cycle by forming vesicles that bud from cellular membranes of different origin, but separation of virion from host membranes is not a trivial or spontaneous step. Several enveloped RNA viruses, such as retroviruses, rhabdoviruses, filoviruses, arenaviruses, and, probably, also ortho and paramyxoviruses, solve such a problem by coopting factors that cells usually employ during the formation of vesicles within specific endosome-derived organelles: the multivesicular bodies (MVBs). Actually, enveloped RNA viruses budding and formation of MVBs intraluminal vesicles are analogous processes: in
both cases membranes must curve and bud away from (rather than into) the cytoplasm. Indeed, a productive infection requires that all the components necessary for the formation of infectious particles localize to the membrane at the site where budding will take place. To that end, RNA viruses evolved two possible strategies: the presence of special sequences named Late domains (L-domains) in their structural proteins and/or their ubiquitylation. In any case proteins involved are recruited to the MVBs pathway. Much less is known about herpesviruses and, in
general, enveloped DNA viruses. In fact, even if the initial steps of the herpetic infection are quite well-known, the cellular site of assembly and pericapsid’s acquisition as well as the nature of the membranes involved in viral budding are not clear yet.
The aim of this work was to elucidate the molecular mechanisms behind essential steps of herpesvirus replication, such as assembly and budding from infected cells. In particular, we used the -herpesvirus HSV-1 as a model. Two recent works pointed
out a possible role of MVBs in HSV-1 replication: both virus gress and intracellular trafficking and maturation of the essential glycoprotein gB require functional biogenesis of MVBs. On the basis of those considerations, we evaluated whether MVBs membranes could be the recruiting site of other main structural proteins, such as the tegumental ones, in order to identify those organelles as the pericapsid’s acquisition and final assembly site of the viral particles.
Most of all, we focused on four HSV-1 tegumental proteins: VP1/2, VP13/14, VP16 and VP22. Especially, we observed that both VP1/2 and VP16 possess sequences belonging to the L-domains motifs and that both VP1/2 and VP16 localize at the
MVBs membranes. We also proved the interaction between the PSAP motif of theprotein and Tsg101, its cellular partner. We supposed that the recruitment of VP1/2 to the MVBs can be due, at least partially, to such interaction. Vice versa, the reason
for the localization of VP16 are not as clear. We demonstrated that VP16 does not show any direct interactions between its PPLY motif and the corresponding cellular partners, the members of the Nedd4 ubiqutin-ligases family. Moreover, our data revealed that VP16 is not even ubiquitylated, a post-translational modification that would ensure its sorting to the MVBs. Supposing that its recruitment to the MVBs was indirect and due to other viral proteins, we verified two of the interactions ascribed to VP16 and other tegument proteins in the literature, especially those related to VP13/14 and VP22. We confirmed that VP16 direct interacts with VP22, in the absence of other viral factors, but not with VP13/14. Still, that interaction did
not explain the intracellular localization of VP16 that could require viral and/or cellular factors other than those examined. Last, by a deeper investigation of both VP22 and VP13/14, we demonstrated that each of those proteins is ubiquitylated and
that the ubiquitylation of VP13/14 is specific for the targeting to the MVBs pathway.
Concluding, our data showed that at least four HSV-1 tegumental proteins are recruited to the MVBs or own the necessary features for such an intracellular localization, that are L-domains or ubiquitin conjugation. So it is possible to suppose
that MVBs could provide the appropriate platform for the tegument assembly and the acquisition of the pericapsid as well as a possible exit from the infected cell.

Abstract (italiano)

Molti virus dotati di envelope completano il proprio ciclo replicativo formando delle vescicole che gemmano attraverso membrane cellulari di varia natura, ma la scissione del virione da tali membrane non è un passaggio semplice o spontaneo. Per
quel che riguarda diversi virus a RNA, tra cui retrovirus, rabdovirus, filovirus, arenavirus e, presumibilmente, orto- e paramixovirus, tale problema è stato risolto mediante il reclutamento di fattori normalmente utilizzati dalla cellula durante la formazione di vescicole interne a specifici organelli membranosi derivati dagli endosomi: i multivesicular bodies (MVB). In effetti, la gemmazione dei virus a RNA dotati di envelope e la formazione delle vescicole interne ai MVB sono
processi analoghi: in entrambi i casi si verifica una curvatura della membrana in allontanamento dal citoplasma. Affinché un’infezione possa considerarsi produttiva, quindi, è necessario che tutti i componenti utili alla formazione della particella siano convogliati a livello della membrana in cui si verificherà l’evento di gemmazione. A questo scopo, i virus a RNA hanno evoluto due possibili strategie: la presenza di particolari sequenze note come Late domain (L-domain) all’interno delle proprie proteine strutturali e/o la loro ubiquitinazione; in entrambi i casi le
proteine coinvolte vengono reclutate nel pathway dei MVB. Molto meno è noto, invece, per quel che riguarda gli herpesvirus e, più in generale, i virus a DNA dotati di envelope. Infatti, se da un lato le fasi iniziali dell’infezione erpetica sono piuttosto conosciute, dall’altro rimangono aperte alcune controversie riguardanti il sito cellulare di assemblaggio e acquisizione del pericapside nonché la natura delle membrane implicate nella gemmazione della particella virale dalla cellula infetta.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di contribuire al chiarimento dei meccanismi molecolari dell’assemblaggio e della gemmazione degli herpesvirus, prendendo come modello il virus dell’herpes simplex di tipo 1 (HSV-1). In particolar modo, due
lavori pubblicati nell’ultimo periodo hanno evidenziato un possibile ruolo dei MVB nel ciclo replicativo di HSV-1 sottolineando l’importanza di una corretta biogenesi di tali organelli per garantire la gemmazione virale e il corretto trafficking intracellulare di una proteina virale essenziale, quale la glicoproteina B. Sulla base di tali riscontri si è deciso di valutare se le membrane dei MVB costituissero il sito di
reclutamento di altre importanti proteine strutturali, quali quelle del tegumento, cosìda poter identificare tali organelli come il sito di acquisizione del pericapside e di assemblaggio definitivo della particella virale.
Nel presente lavoro ci siamo focalizzati soprattutto su quattro proteine del tegumento di HSV-1: VP1/2, VP13/14, VP16 e VP22. In particolar modo, abbiamo dimostrato che VP1/2 e VP16 presentano al proprio interno sequenze riconducibili a L-domain
noti e che sia VP1/2 che VP16 localizzano a livello delle membrane dei MVB. Il reclutamento di VP1/2 a livello di tali organelli può essere attribuito, almeno in parte, all’interazione tra il dominio PSAP in essa contenuto e la proteina Tsg101, suo
partner cellulare, con cui abbiamo dimostrato l’associazione. Viceversa, le cause della localizzazione di VP16 non sono altrettanto chiare. Infatti, abbiamo dimostrato che VP16 non presenta alcuna interazione diretta tra il dominio PPLY in essa
presente e i corrispondenti partner cellulari, i membri della famiglia delle ubiquitino-ligasi Nedd4. Inoltre, in base ai nostri dati, la medesima proteina non risulta nemmeno ubiquitinata, modifica post-traduzionale che ne garantirebbe il direzionamento ai MVB. Nell’ipotesi che il suo reclutamento ai MVB sia di tipo
indiretto e dovuto all’azione di altre proteine virali, abbiamo quindi verificato alcune tra le interazioni riportate in letteratura per quel che riguarda VP16 e le altre proteine del tegumento, in particolare VP13/14 e VP22. Dai nostri esperimenti è emerso che VP16 interagisce direttamente con VP22, in assenza di altri fattori virali, ma non con VP13/14. Tuttavia, nemmeno il legame con VP22 è risultato tale da giustificare la localizzazione intracellulare di VP16, che quindi potrebbe richiedere fattori virali e/o cellulari diversi da quelli analizzati. Infine, mediante studi più approfonditi su VP22 e VP13/14, abbiamo dimostrato che entrambi tali proteine risultano ubiquitinate e che, nel caso specifico di VP13/14, tale ubiquitinazione è del tipo generalmente responsabile del direzionamento di una proteina al pathway dei MVB.
In conclusione, i nostri dati dimostrano che almeno quattro proteine del tegumento sono effettivamente reclutate ai MVB o possiedono le caratteristiche necessarie ad una simile localizzazione, quali la presenza di L-domain o la coniugazione
all’ubiquitina. E’ quindi possibile supporre che tali organelli, oltre a rappresentare una potenziale via d’uscita dalla cellula infettata, possano fornire anche la “piattaforma” cellulare adatta al completamento dell’assemblaggio del tegumento e all’acquisizione del pericapside da parte della particella virale.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Palù, Giorgio
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 21 > Corsi per il 21simo ciclo > VIROLOGIA E BIOTECNOLOGIE MICROBICHE
Data di deposito della tesi:28 Gennaio 2009
Anno di Pubblicazione:2009
Parole chiave (italiano / inglese):HSV-1 Multivesicular bodies Assemblaggio Late domain Ubiquitinazione VP1/2 VP16 VP13/14 VP22
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche
Codice ID:1533
Depositato il:28 Gen 2009
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