Avian influenza viruses (in particular highly pathogenic avian influenza viruses) pose a concern both for public and animal health. Over the last decade, in fact, a sharp increase in the number of outbreaks in birds, especially poultry, has occurred with a high economic impact on the commercial poultry sector with the death or culling of millions of birds worldwide. In addition, from the public health perspective, several of these viruses have crossed the species barrier and infected human beings as well. In some instances, this has resulted in a self-limiting conjunctivitis or influenza-like illness, while in others in more severe conditions, which led to the death of the individual. The aim of the present paper was to investigate the pathogenicity and transmissibility of same avian influenza viruses in animal models. In particular, avian influenza viruses of the H7 subtype that are widely diffused worldwide and were implicated in one of the major outbreaks, the 1999-2000 H7N1 HPAI outbreak, were focused on and used for the experimental infections reported in the present paper. In detail, to increase knowledge on the risk connected to the consumption of commodities coming from infected poultry, it was performed an experimental infection in unvaccinated and vaccinated turkeys with HPAI and LPAI viruses of the H7N1 subtypes. The aim of the study was to determine the ability of LPAI and HPAI H7N1 viruses to reach muscle tissues following experimental infection and the efficacy of vaccination in preventing viraemia and meat localisation. The potential of infective muscle tissue to act as a source of infection for susceptible poultry by mimicking the practice of swill-feeding was also investigated. Results obtained indicated that the HPAI virus was isolated from blood and muscle tissues of all unvaccinated turkeys, while LPAI could be isolated only from blood and could be detected only by RT-PCR in muscles. In contrast, in vaccinated/ challenged turkeys, no viable virus or viral RNA could be detected in muscles indicating that in vaccinated birds viral localisation in muscle tissue is prevented. No infection was detected in poultry fed on infected meat. Further studies were performed to understand the zoonotic potential of the H7N1 HPAI viruses in mammals using the mouse model. In particular it was enlightened the pathogenicity of selected HPAI viruses infecting mice through nasal infection. In fact, sequence analysis of viruses from the Italian epidemic indicated that a natural isolate from an ostrich (Struthio camelus) had a lysine (K) residue at position 627 of the PB2 protein (PB2-627K). This mutation is very rare in avian origin isolates, the vast majority of which have a glutamic acid (E) residue in this position. It was showed that the isolated possessing the lysine residue exhibited enhanced virulence in mice, in comparison to isolates lacking this mutation. In particular, it was showed a marked pneumo and neurovirulence of H7N1 HPAI isolates in mice. Due to the fact that apart from ferrets, no data were available on the transmission of H7 influenza viruses in mice, there were used mice to asses if Italian H7N1 HPAI viruses could be transmitted in this species. It was demonstrated that H7N1 HPAI viruses could transmit to naïve mice place in direct contact with infected mice. In addition the results showed that transmission occurred by contact through oro-nasal secretions, containing high viral load. In conclusion, the data generated during the experimental infections herein reported underlined once again the pathogenicicty of H7N1 viruses both for poultry (turkey) and mammal (mouse). The zoonotic potential of these viruses therefore is very high, all the more due to their ability to transmit from infected to healthy mice. Finally, the vaccination appears to be an effective tool to prevent the active circulation of avian influenza viruses and then the acquisition of potentially dangerous mutations.

I virus dell’influenza aviaria, soprattutto quelli ad alta patogenicità, rappresentano un serio problema per la sanità animale ed umana. Negli ultimi dieci anni, infatti, un netto aumento dei focolai di influenza aviaria ha coinvolto in tutto il mondo i volatili selvatici ma soprattutto il pollame domestico con un impatto economico enorme per il settore avicolo dovuto alla morte e/o abbattimento di migliaia di volatili. Inoltre molti di questi virus sono stati in grado di superare le barriere di specie infettando i mammiferi ed in particolare l’uomo. In molti casi l’infezione nell’uomo si è risolta con una sindrome simil-influenzale o con forme di congiuntivite, ma in altrettanti casi ha portato al decesso dei soggetti infetti. La presente tesi ha lo scopo di approfondire alcuni aspetti legati alla patogenicità e trasmissibilità dei virus dell’influenza aviaria in modelli animali. Per effettuare gli esperimenti descritti nella presente tesi, sono stati scelti ed utilizzati virus dell’influenza aviaria di sottotipo H7, che sono molto diffusi in tutto il modo e sono stati causa di alcuni dei focolai di malattia più gravi che si ricordino, come l’epidemia italiana del 1999-2000. In particolare, per aumentare le informazioni disponibili relativamente al rischio di contaminazione delle carni e dei prodotti derivati da avicoli infetti, è stata effettuata una infezione sperimentale con virus H7N1 ad alta e bassa patogenicità in tacchini vaccinati e non. Lo scopo dell’infezione è stato quello di determinare la capacità di diffusione dei virus H7N1 HPAI e LPAI nei tessuti muscolari e nel sangue di tacchino e di valutare l’efficacia della vaccinazione nel prevenirla. Infine è stato valutato anche il rischio di infezione del pollame connesso al consumo di carni simulando un pasto di carne infetta. I risultati ottenuti hanno dimostrato come il virus HPAI si ritrovi costantemente nel sangue e nei muscoli degli animali non vaccinati ed infetti, mentre il virus LPAI è stato ritrovato a basso titolo solo nel sangue di un soggetto non vaccinato e solo tramite la RRT-PCR nei muscoli di alcuni altri soggetti non vaccinati. La vaccinazione si è dimostrata quindi molto efficace nel prevenire l’instaurarsi della viremia e quindi della diffusione del virus nelle carni in animali infettati sia con virus ad alta che a bassa patogenicità. Non è stata rilevata infine infezione nei soggetti nutriti con il muscolo infetto e pertanto il rischio di diffusione della malattia connesso a questa pratica sembra essere ridotto. Ulteriori esperimenti sono stati effettuati per approfondire il rischio zoonosico dei virus H7N1 HPAI italiani nel mammifero utilizzando come modello il topo. In particolare sono stati selezionati alcuni virus H7N1 per infettare gruppi di topi per via nasale. Infatti le sequenze geniche effettuate sui virus isolati in Italia nel 1999-2000 hanno evidenziato un isolato da struzzo (Struthio camelus) caratterizzato dalla presenza di una lisina in posizione 627 del gene codificante per la proteina PB2. Questa mutazione è estremamente rara negli isolati di origine aviari, che generalmente presentano in tale posizione un acido glutammico, e sembra influenzare in modo determinante la patogenicità virale. I dati ottenuti durante questa infezione sperimentale hanno dimostrato che i virus che posseggono tale mutazione hanno un’aumentata patogenicità per il topo caratterizzata da marcato neuro e pneumotropismo. Infine, a causa della carenza di dati relativi alla capacità di trasmettersi di questi virus nel topo, è stato sviluppato un modello sperimentale per valutare la trasmissibilità di virus H7N1 HPAI nell’ospite murino. E’ stata dimostrata quindi per la prima volta la capacità di tali virus di trasmettersi da topi infetti a topi sentinella sani posti a diretto contato con essi. La trasmissione è avvenuta a causa del contatto con le secrezioni nasali di soggetti infettati sperimentalmente che si sono dimostrate particolarmente cariche di virus. I dati prodotti dalle infezioni sperimentali effettuate, quindi, sottolineano ancora una volta come i virus influenzali H7N1 siano caratterizzati da una elevata patogenicità sia per l’ospite aviario (tacchino) che per l’ospite mammifero (topo). Il potenziale zoonotico di questi virus non è da sottovalutare, data anche la loro capacità di trasmettersi da topi infetti a topi sani. La vaccinazione infine appare essere un valido strumento di lotta alla diffusione dei virus influenzali aviari nei volatili e quindi di prevenzione del rischio connesso alla loro capacità di infettare nuovi ospiti e di acquisire mutazioni potenzialmente pericolose.

Influenza aviaria: valutazione della patogenicità e trasmissibilità di virus H7N1 italiani in modelli animali / Toffan, Anna. - (2008).

Influenza aviaria: valutazione della patogenicità e trasmissibilità di virus H7N1 italiani in modelli animali

Toffan, Anna
2008

Abstract

I virus dell’influenza aviaria, soprattutto quelli ad alta patogenicità, rappresentano un serio problema per la sanità animale ed umana. Negli ultimi dieci anni, infatti, un netto aumento dei focolai di influenza aviaria ha coinvolto in tutto il mondo i volatili selvatici ma soprattutto il pollame domestico con un impatto economico enorme per il settore avicolo dovuto alla morte e/o abbattimento di migliaia di volatili. Inoltre molti di questi virus sono stati in grado di superare le barriere di specie infettando i mammiferi ed in particolare l’uomo. In molti casi l’infezione nell’uomo si è risolta con una sindrome simil-influenzale o con forme di congiuntivite, ma in altrettanti casi ha portato al decesso dei soggetti infetti. La presente tesi ha lo scopo di approfondire alcuni aspetti legati alla patogenicità e trasmissibilità dei virus dell’influenza aviaria in modelli animali. Per effettuare gli esperimenti descritti nella presente tesi, sono stati scelti ed utilizzati virus dell’influenza aviaria di sottotipo H7, che sono molto diffusi in tutto il modo e sono stati causa di alcuni dei focolai di malattia più gravi che si ricordino, come l’epidemia italiana del 1999-2000. In particolare, per aumentare le informazioni disponibili relativamente al rischio di contaminazione delle carni e dei prodotti derivati da avicoli infetti, è stata effettuata una infezione sperimentale con virus H7N1 ad alta e bassa patogenicità in tacchini vaccinati e non. Lo scopo dell’infezione è stato quello di determinare la capacità di diffusione dei virus H7N1 HPAI e LPAI nei tessuti muscolari e nel sangue di tacchino e di valutare l’efficacia della vaccinazione nel prevenirla. Infine è stato valutato anche il rischio di infezione del pollame connesso al consumo di carni simulando un pasto di carne infetta. I risultati ottenuti hanno dimostrato come il virus HPAI si ritrovi costantemente nel sangue e nei muscoli degli animali non vaccinati ed infetti, mentre il virus LPAI è stato ritrovato a basso titolo solo nel sangue di un soggetto non vaccinato e solo tramite la RRT-PCR nei muscoli di alcuni altri soggetti non vaccinati. La vaccinazione si è dimostrata quindi molto efficace nel prevenire l’instaurarsi della viremia e quindi della diffusione del virus nelle carni in animali infettati sia con virus ad alta che a bassa patogenicità. Non è stata rilevata infine infezione nei soggetti nutriti con il muscolo infetto e pertanto il rischio di diffusione della malattia connesso a questa pratica sembra essere ridotto. Ulteriori esperimenti sono stati effettuati per approfondire il rischio zoonosico dei virus H7N1 HPAI italiani nel mammifero utilizzando come modello il topo. In particolare sono stati selezionati alcuni virus H7N1 per infettare gruppi di topi per via nasale. Infatti le sequenze geniche effettuate sui virus isolati in Italia nel 1999-2000 hanno evidenziato un isolato da struzzo (Struthio camelus) caratterizzato dalla presenza di una lisina in posizione 627 del gene codificante per la proteina PB2. Questa mutazione è estremamente rara negli isolati di origine aviari, che generalmente presentano in tale posizione un acido glutammico, e sembra influenzare in modo determinante la patogenicità virale. I dati ottenuti durante questa infezione sperimentale hanno dimostrato che i virus che posseggono tale mutazione hanno un’aumentata patogenicità per il topo caratterizzata da marcato neuro e pneumotropismo. Infine, a causa della carenza di dati relativi alla capacità di trasmettersi di questi virus nel topo, è stato sviluppato un modello sperimentale per valutare la trasmissibilità di virus H7N1 HPAI nell’ospite murino. E’ stata dimostrata quindi per la prima volta la capacità di tali virus di trasmettersi da topi infetti a topi sentinella sani posti a diretto contato con essi. La trasmissione è avvenuta a causa del contatto con le secrezioni nasali di soggetti infettati sperimentalmente che si sono dimostrate particolarmente cariche di virus. I dati prodotti dalle infezioni sperimentali effettuate, quindi, sottolineano ancora una volta come i virus influenzali H7N1 siano caratterizzati da una elevata patogenicità sia per l’ospite aviario (tacchino) che per l’ospite mammifero (topo). Il potenziale zoonotico di questi virus non è da sottovalutare, data anche la loro capacità di trasmettersi da topi infetti a topi sani. La vaccinazione infine appare essere un valido strumento di lotta alla diffusione dei virus influenzali aviari nei volatili e quindi di prevenzione del rischio connesso alla loro capacità di infettare nuovi ospiti e di acquisire mutazioni potenzialmente pericolose.
2008
Avian influenza viruses (in particular highly pathogenic avian influenza viruses) pose a concern both for public and animal health. Over the last decade, in fact, a sharp increase in the number of outbreaks in birds, especially poultry, has occurred with a high economic impact on the commercial poultry sector with the death or culling of millions of birds worldwide. In addition, from the public health perspective, several of these viruses have crossed the species barrier and infected human beings as well. In some instances, this has resulted in a self-limiting conjunctivitis or influenza-like illness, while in others in more severe conditions, which led to the death of the individual. The aim of the present paper was to investigate the pathogenicity and transmissibility of same avian influenza viruses in animal models. In particular, avian influenza viruses of the H7 subtype that are widely diffused worldwide and were implicated in one of the major outbreaks, the 1999-2000 H7N1 HPAI outbreak, were focused on and used for the experimental infections reported in the present paper. In detail, to increase knowledge on the risk connected to the consumption of commodities coming from infected poultry, it was performed an experimental infection in unvaccinated and vaccinated turkeys with HPAI and LPAI viruses of the H7N1 subtypes. The aim of the study was to determine the ability of LPAI and HPAI H7N1 viruses to reach muscle tissues following experimental infection and the efficacy of vaccination in preventing viraemia and meat localisation. The potential of infective muscle tissue to act as a source of infection for susceptible poultry by mimicking the practice of swill-feeding was also investigated. Results obtained indicated that the HPAI virus was isolated from blood and muscle tissues of all unvaccinated turkeys, while LPAI could be isolated only from blood and could be detected only by RT-PCR in muscles. In contrast, in vaccinated/ challenged turkeys, no viable virus or viral RNA could be detected in muscles indicating that in vaccinated birds viral localisation in muscle tissue is prevented. No infection was detected in poultry fed on infected meat. Further studies were performed to understand the zoonotic potential of the H7N1 HPAI viruses in mammals using the mouse model. In particular it was enlightened the pathogenicity of selected HPAI viruses infecting mice through nasal infection. In fact, sequence analysis of viruses from the Italian epidemic indicated that a natural isolate from an ostrich (Struthio camelus) had a lysine (K) residue at position 627 of the PB2 protein (PB2-627K). This mutation is very rare in avian origin isolates, the vast majority of which have a glutamic acid (E) residue in this position. It was showed that the isolated possessing the lysine residue exhibited enhanced virulence in mice, in comparison to isolates lacking this mutation. In particular, it was showed a marked pneumo and neurovirulence of H7N1 HPAI isolates in mice. Due to the fact that apart from ferrets, no data were available on the transmission of H7 influenza viruses in mice, there were used mice to asses if Italian H7N1 HPAI viruses could be transmitted in this species. It was demonstrated that H7N1 HPAI viruses could transmit to naïve mice place in direct contact with infected mice. In addition the results showed that transmission occurred by contact through oro-nasal secretions, containing high viral load. In conclusion, the data generated during the experimental infections herein reported underlined once again the pathogenicicty of H7N1 viruses both for poultry (turkey) and mammal (mouse). The zoonotic potential of these viruses therefore is very high, all the more due to their ability to transmit from infected to healthy mice. Finally, the vaccination appears to be an effective tool to prevent the active circulation of avian influenza viruses and then the acquisition of potentially dangerous mutations.
Influenza aviaria, patogenicità, trasmissibilità, tacchino, topo, vaccinazione
Influenza aviaria: valutazione della patogenicità e trasmissibilità di virus H7N1 italiani in modelli animali / Toffan, Anna. - (2008).
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