Characterization and role of the transcription factor cAMP response element binding protein (CREB) in childhood leukemia

We investigated the transcription factor cyclic adenosine monophosphate response-element binding protein (CREB) in childhood acute leukemia. We analyzed CREB expression in series of bone marrow samples from children with acute lymphoblast (ALL) or myeloid leukemia (AML) at diagnosis and during remission therapy. We documented that CREB protein was significantly (p<0.001) over expressed in 84% of patients with ALL and 66% of those with AML. CREB protein was always present in the active phosphorylated form, and transcriptional active wholly at diagnosis of leukemia. In order to find the causes of CREB abnormalities we looked at CREB mRNA which was not amplified and at gene sequencing analyses that revealed a wild type genome in leukemic samples. cAMP concentration was then measured but not significant differences in diagnosis samples respect to controls were found. We described an inverse correlation between CREB and its inducible cAMP early repressor (ICER) mRNA expression and decided to considere this phenomenon to be better elucidated. ICER and CREB are both transcriptional activator and repressor, respectively, of the cAMP-mediated signaling pathway. The research continued by looking at the possible function of restored ICER expression in leukemia cell lines. ICER exogenously expressed in HL60 was demonstrated to decrease CREB protein level and induce a lowered clonogenic potential in vitro. ICER was demonstrated to repress a series of genes involved in cell cycle, proliferation and MAPK signaling. Its binding to CRE promoters confirmed its role in controlling gene expression of the main cellular pathways. HL60 cell line expressing ICER was then evaluated in their ability to repopulate non-obese diabetic-severe combined immunodeficient mice demonstrating a lower extramedullary sites invasion and bone marrow angiogenesis. So, its potential effects on tumor progression was documented in vivo. We then tried to give a reason of ICER lower expression found in HL60 and demonstrated that it was subjected to degradation through a constitutively active form of the extracellular signal-regulated protein kinase (ERK1/2) maintained by CREB, which drives it to the proteasome. Considerable attention was focused on the role played by ICER in the control of genes related to apoptosis and MAPK signaling and chemotherapics were used as stimuli for cell death. We found that a series of ICER’s target cyclins, phosphatases DUSP1/4, kinases and oncogenes were strongly downregulated after chemotherapic treatment, supporting ICER restored expression to confer an enhanced sensibility to drugs to leukemic cells. Cell cycle was impaired and apoptosis significantly increased. Addressing the mechanism by which exogenous ICER improves apoptosis, we found that the simple inhibition of DUSP1/4 phosphatases expression triggers the activation of the p38 apoptotic pathway and the disruption of ERK, AKT and RAS survival signaling. This is a process caspases dependent and abrogated by p38 specific inhibitor. We reveal that ICER induces CREB proteasome degradation supporting apoptotic signaling and a lowered tumorigenicity. ICER is here proposed to be able to switch leukemia cell fate from survival to apoptosis by counteracting CREB transcriptional activity and modifing its protein stability. At this point, we revealed that CREB was overexpressed in leukemia, but the underlying mechanism remained unknown. MicroRNAs , that act as negative regulators of gene expression principally through translational repression, were then investigated for the mediation of high CREB protein levels. A series of miRNAs which target CREB were identified. RQ-PCR revealed that miR-34b was expressed significantly less in myeloid cell lines, previously known for high CREB protein levels. Exogenous miR-34b expression was induced, and results revealed a direct interaction with CREB in vitro. MiR-34b restored expression caused cell cycle abnormalities, reduced anchorage independent growth, and altered CREB target gene expression, suggesting its suppressor potential. CREB target proteins (BCL-2, Cyclins A1, B1, D, NfKB, JAK1, STAT3), as well as many downstream protein kinases and cell survival signaling pathways (AKT/mTOR, ERK) usually elicited by CREB, were observed to have decreased. The miR-34b/34c promoter was demonstrated to be methylated finding this epigenetic regulation able to control the observed lower miR-34b expression levels in order to maintain the CREB protein overexpressed. In addition, the inverse correlation between miR-34b and CREB expression was found in a cohort of pediatric patients at diagnosis of acute myeloid leukemia, supporting this relationship also in vivo. Finally, the research defines CREB as an oncogene and ICER as a tumor suppressor in leukemia. Unbalanced CREB/ICER expression needs to be considered a pathogenetic feature in leukemogenesis. Our results identify a targets and pathways to be considered for future therapeutic approaches. The direct miR-34b targeting of CREB provides new information about myeloid transformation.

In questo dottorato di ricerca è stato studiato il fattore di trascrizione CREB che dirige l’espressione genica regolata per lo più dall’ AMPciclico. CREB è uno dei fattori di trascrizione più conosciuti, ma ancora poco è noto del suo ruolo fisiologico e oncologico nel tessuto ematopoietico. L’espressione proteica di CREB è stata definita in linee cellulari leucemiche e in una ampia coorte di pazienti all’esordio di leucemia acuta linfoide (LLA) o leucemia acuta mieloide (LMA). I dati sono stati confrontati con quelli ottenuti dall’analisi di prelievi raccolti durante il follow up in documentata remissione di malattia e donatori sani. I risultati hanno evidenziato una elevata espressione proteica di CREB nell’84% delle ALL e nel 66% delle LAM (p<0.001). Il legame specifico di CREB con i siti di riconoscimento cAMP-Responsive-Element (CRE, 5’TGACGTCA3’) sui promotori si è dimostrato avvenire esclusivamente nei prelievi alla diagnosi di leucemia dove dunque l’overespressione di CREB sosteneva la possibilità di una sua attività trascrizionale anomala. Per capire le cause di questo fenomeno sono stati misurati i livelli di CREB mRNA che non erano significativamente differenti negli esordi rispetto ai controlli utilizzati. E’ stato condotto il sequenziamento del gene CREB, e dei domini di interazione tra CREB la CREB binding protein (CBP) in quanto necessario alla attivazione trascrizionale, che però non ha rivelato nessuna mutazione tale da giustificare l’overespressione di CREB. Infine è stata misurata la quantità di cAMP che non è risultata significativamente diversa nei campioni all’esordio rispetto ai controlli. Allo stesso fine, è stata valutata l’espressione del cAMP inducible early repressor (ICER). ICER si è dimostrato essere sotto espresso all’esordio di leucemia e upregolato nei prelievi in remissione e nei donatori sani, contrariamenti ai livelli espressione di CREB documentati nei medesimi campioni. La ricerca è proseguita con lo studio di ICER, che è un fattore di trascrizione noto riconoscere CRE nei promotori con la funzione di reprimerne la trascrizione. ICER dunque ha il ruolo di modulare l’attività di CREB controllando l’espressione genica in diversi tessuti. Essendo ICER sotto espresso nel tessuto leucemico è stato da noi costruito un modello in vitro reintroducendo una esogena espressione di ICER in linee cellulari. E’ stato dimostrato che l’espressione esogena di ICER induceva una diminuzione della proteina CREB e una alterazione di una serie di geni target. I promotori di alcuni geni, scelti per svolgere attività cellulari primarie quali la proliferazione e la sopravvivenza, sono stati dimostrati infatti essere occupati da ICER invece che da CREB. Le attività cellulari delle HL60 risultavano fortemente modificate: la capacità di formare colonie dei blasti esprimenti ICER in vitro era fortemente ridotta, supportando l’ipotesi che ICER potesse svolgere il ruolo di onco-soppressore. E’ stato così utilizzato un test di ripopolamento in vivo in topi NOD-SCID con le HL60 stabilizzate con ICER e HL60 stabilizzate con il vettore vuoto. La linea leucemica si è dimostrata meno tumorigenica se esprimente ICER, la disseminazione dei blasti nel sangue periferico e nella milza era molto rallentata e l’angiogenesi ridotta. L’identificazione di quali geni ICER fosse in grado di reprimere e quindi contrastare il fenotipo leucemico sono stati studiati. I dati di espressione genica hanno dimostrato che ICER reprimeva per lo più geni del ciclo cellulare, dell’apoptosi e del pathway delle MAPK. Con l’utilizzo di chemioterapici come stimoli apoptotici è stato dimostrato che alcune cicline, le fosfatasi DUSP1/4, alcune MAP chinasi e importanti oncogeni, tutte proteine target di ICER, erano fortemente represse nelle cellule leucemiche se esprimenti ICER esogeno, rispetto alle stesse cellule non trattate con farmaci. Il trattamento inoltre induceva un blocco del ciclo cellulare e una aumentata apoptosi dimostrando che ICER conferiva una maggior sensibilità ai farmaci. In particolare,è stato dimostrato che il pathway pro-apoptotico diretto dalla proteina di stress p38 si manteneva attivo grazie alla repressione di DUSP1/4 indotta da ICER, fornendo così il pathway diretto da ICER e nuovi target terapeutici. Infine, sono state indagate le cause della bassa espressione di ICER all’esordio di malattia. E’ stato dimostrato che il pathway legato alla kinase ERK1/2, fortemente mantenuto anche dagli elevati livelli di CREB, permetteva a ERK1/2 di fosforilare ICER e portarlo alla degradazione via proteasoma. Inoltre, è stato dimostrato che una volta reintrodotta l’espressione di ICER in HL60, ICER dimerizzava con CREB portando quest’ultimo alla degradazione via proteasoma, spiegando dunque i bassi livelli di CREB nel nostro modello in vitro. Infine la ricerca si è concentrata sul cercare di determinare le cause della iper espressione di CREB nella leucemia. L’osservazione che i livelli proteici di CREB erano alterati, ma non i livelli di mRNA, ha condotto lo studio verso il ruolo delle modifiche post-trascrizionali. L’ipotesi che CREB rimanesse ad alti livelli per anomalie di traduzione ha spinto l’analisi verso la ricerca di possibili microRNAs. E’ stato condotto uno studio di 5 micrornas su una serie di linee cellulari mieloidi che ha permesso di puntare su miR-34b in quanto la sua espressione era fortemente abbassata nelle linee leucemiche in concomitanza agli elevati livelli di CREB. MiR-34b è stato così re-inserito nelle linee come oligonucleotide esogeno ed è stato dimostrato che provocava un drastico abbassamento dei livelli di CREB, con conseguente diminuzione dell’espressione genica e proteica dei target di CREB. La vitalità cellulare inoltre era compromessa, compresa la capacità di formare colonie. Il fatto che miR-34b si mantenesse sotto espresso nella leucemia è stato dimostrato dipendere dalla metilazione del suo promotore. Alle analisi in vitro, sono state affiancate le analisi di espressione di miR-34b in una serie di pazienti all’esordio di LAM, dimostrando che anche in vivo miR-34b è fortemente sotttoespresso e CREB upregolato. Infine, la ricerca ha caratterizzato il gene CREB come un oncogene e ICER come un oncosopressore nella leucemia mieloide. La modulazione della loro espressione risulta di fondamentale importanza nel mantenimento del tumore. La caratterizzazione di nuovi geni target e pathways cellulari implicati nella leucemia mieloide aprono nuove prospettive di studio e di possibilità terapeutiche.La caratterizzazione di CREB come target di miR-34b e la metilazione del promotore come evento regolatore dei livelli di proteina nella leucemia, confermano l’importanza degli eventi epigenetici nella leucemogenesi.