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Bonaiuto, Emanuela (2009) Ammino Ossidasi umana sensibile alla semicarbazide: dalla caratterizzazione cinetica agli studi cellulari in adipociti. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Human Semicarbazide-Sensitive Amine Oxidase (SSAO/VAP-1) is a transmembrane glycoprotein, which catalyzes the oxidative deammination of primary amines to aldehydes, with the release of the ammonium ion and hydrogen peroxide. The physiological role of SSAO/VAP-1 is not still clear: in adipocytes, SSAO/VAP-1 activity has an “insuline” like effect, while in vascular and sinusoidal hepatic endothelium, SSAO/VAP-1 is involved in the leucocyte extravasation at sites of inflammation. On these basis, the development of new specific inhibitors for SSAO/VAP-1 is an important target for the development of new anti-inflammatory drugs, while the development of new specific substrates can help to clarify the physio-pathological functions of this enzyme.
To obtain information about the characteristics of a molecule to be recognized by human SSAO active site, a kinetic characterization of SSAO/VAP-1 from adipocytes was performed. Primary amines, with different size, sterical hindrance and charge distribution were used as “probe-substrates”. 1,12 diaminododecane and cis-4-chloro-butenylamine resulted the substrates with the higher catalytic efficiency among those tested. From these measurements, it was possible to estimate the value of the dielectric constant of the active site of SSAO/VAP-1, that was found to be in the range 10-20. From the effect of pH on Vmax/KM of SSAO/VAP-1 for some substrates, it was possible to highlight that a residue in its protonated form impedes the catalysis. The preliminary analysis of the 3D structures of VAP-1 shows that this residue could be Lys 393. From the effect of ionic strength and of temperature on the enzyme activity it appeared that the hydrophobic effect has an important role in the active site-substrate recognition step. Various classes of compounds (phosphonium and ammonium salts, pyridine and aniline derivatives and N-oxides) as SSAO/VAP-1 inhibitors were also tested . Although they are good inhibitors of the bovine serum enzyme and of 82% of sequence homology between the two enzymes, they resulted poor inhibitors of the human SSAO/VAP-1 (with Ki=3-4mM).
From these studies, it emerges that a potential good substrate (or inhibitor) for the human SSAO/VAP-1 should be a molecule characterized by a large apolar moiety and by the presence of a positive charge at a distance higher than 10-12 ? from the reactive amino group.
To obviate the use of radioactive isotopes, a discontinuos fluorimetric method for the detection of SSAO/VAP-1 activity in human plasma was set up. The method was validated and applied to the measurement of soluble SSAO/VAP-1 activity in human plasma from healthy controls and from patients with various diseases. A significant increase of soluble SSAO/VAP-1 activity was found in patients with “moderate-severe” Alzheimer disease and in patients with coronary stent implantation. In these patients in addition to SSAO/VAP-1 augment, an increase of circulating extracellular superoxide dismutase activity was also found, suggesting a condition of “oxidative stress”, probably due to the presence of the stent. In the patients with hepatic cirrhosis (induced by alcohol abuse) it was possible to highlight an increase of soluble SSAO/VAP-1 activity in the patients with “mild-moderate” hepatic cirrhosis (according to Child score), while in the patients with “severe” hepatic cirrhosis this increase of activity is lower. These results suggest that high levels of soluble SSAO/VAP-1 are the consequence of an intense inflammatory response, while the relative decrease of the SSAO/VAP-1 level in plasma in the severe state of cirrhosis, could be due to a fall down of the immune defences in these patients.
To investigate a possible role of SSAO/VAP-1 activity in adipocytes, a preliminary study was carried out incubating the cells with insuline, methylamine, catalase and malvidine 3-glucoside. From this study, it appears that some proteins are differently expressed in the presence of these factors. In particular, the presence of insuline, methylamine and malvidine 3-glucoside appears to modulate the expression of SSAO/VAP-1 and of MAO, suggesting that both the enzymes are involved in a common signaling pathway, mediated by the insuline. In future the identification of the expressed proteins by Mass-Spectrometry, associated with Immunoblotting, using specific antibodies may contribute to clarify the connection between SSAO/VAP-1 and insuline pathway and will contribute to obtain new information about the role of this enzyme.

Abstract (italiano)

L’ammino ossidasi umana sensibile alla semicarbazide (SSAO/VAP-1) è una glicoproteina transmembrana, che catalizza la deamminazione ossidativa di ammine primarie ad aldeidi, con rilascio dello ione ammonio e perossido di idrogeno. Il suo ruolo fisiologico non è ancora chiaro: in adipociti, l’attività SSAO/VAP-1 ha un effetto che mima quello dell’insulina, mentre nell’endotelio vascolare e sinusoidale epatico, SSAO/VAP-1 è coinvolta nell’extravasazione dei leucociti ai siti di infiammazione. Su queste basi, lo sviluppo di nuovi specifici inibitori per SSAO/VAP-1 è un target importante per lo sviluppo di nuovi farmaci antinfiammatori, mentre lo sviluppo di nuovi specifici substrati può contribuire a chiarire le funzioni fisio-patologiche di questo enzima.
Per ottenere informazioni sulle caratteristiche che una molecola dovrebbe possedere per essere riconosciuta dal sito attivo dell’enzima umano SSAO, è stata eseguita una caratterizzazione cinetica di SSAO/VAP-1 da adipociti, utilizzando ammine primarie, caratterizzate da differente lunghezza, ingombro sterico e distribuzione di carica. L’1,12 diamminododecano e la cis-4-cloro-butenilammina sono risultati i substrati con la più alta efficienza catalitica fra quelli provati. E’ stato possibile stimare il valore di costante dielettrica del sito attivo di SSAO/VAP-1, che è compreso in un intervallo di circa 10-20. Dall’effetto del pH sul rapporto Vmax/KM della SSAO/VAP-1 per alcuni substrati, è stato possibile evidenziare che un residuo nella sua forma protonata inibisce la catalisi. Da un’analisi preliminare delle strutture 3D di VAP-1, questo residuo potrebbe essere la lisina 393. Dall’effetto della forza ionica e della temperatura sull’attività enzimatica è stato possibile dedurre che l’effetto idrofobico sembra avere un ruolo importante nella fase di riconoscimento substrato - sito attivo della SSAO/VAP-1. Sono state anche provate varie classi di composti (sali di fosfonio ed ammonio, piridina, anilina e i suoi derivati e gli N-ossidi), che sebbene siano buoni inibitori per l’enzima da siero bovino, si sono rivelati inibitori poco efficienti per l’enzima umano SSAO/VAP-1 (valori minimi di Ki=3-4 mM), anche se l’omologia di sequenza fra i due enzimi è elevata (82%). Dall’insieme di questi studi, è emerso che un buon substrato o inibitore per l’enzima umano SSAO/VAP-1 dovrebbe essere una molecola caratterizzata da una larga porzione apolare e dalla presenza di una carica positiva ad una distanza maggiore di 10-12 ? dal gruppo amminico reattivo.
Per ovviare all’impiego di isotopi radioattivi, è stato messo a punto un metodo fluorimetrico discontinuo per la misura dell’attività di SSAO/VAP-1 nel plasma umano. Il metodo è stato validato e applicato alla misura dell’attività della forma solubile di SSAO/VAP-1 nel plasma umano di individui controllo e in pazienti affetti da diverse patologie. Un aumento significativo dei livelli di attività SSAO/VAP-1 plasmatica è stato trovato in pazienti con Alzheimer “moderato-grave” ed in pazienti con impianto di stent coronarico. In questi pazienti oltre a SSAO/VAP-1, è stato trovato inoltre un aumento dei livelli di attività della superossido dismutasi circolante nel plasma, suggerendo una condizione di “stress ossidativo”, probabilmente dovuta alla presenza dello stent. Nel caso dei pazienti con cirrosi epatica esotossica (indotta da abuso di alcool), è stato messo in luce un aumento dell’attività della forma solubile si SSAO/VAP-1 nei pazienti con cirrosi epatica “lieve-moderata” (classificazione Child), mentre nei pazienti con cirrosi epatica “grave”, questo aumento si riduce. I risultati ottenuti suggeriscono che elevati livelli della forma solubile di SSAO/VAP-1, sono la conseguenza di un’intensa risposta infiammatoria, mentre la relativa diminuzione del livello di SSAO/VAP-1 nello stato più grave della patologia, potrebbe essere dovuto ad un crollo delle difese immunitarie in questi pazienti.
Per cercare di chiarire un possibile ruolo dell’attività di SSAO/VAP-1 negli adipociti, è stato condotto uno studio preliminare trattando le cellule con fattori quali insulina, metilammina, catalasi e malvidina 3-glucoside. L’analisi SDS-PAGE, evidenzia che alcune proteine sono espresse in maniera differente nell’incubazione degli adipociti con questi fattori. In particolare, la presenza di questi composti modula l’espressione di SSAO/VAP-1 e delle MAO, suggerendo che entrambi gli enzimi sono coinvolti in una comune via di segnale, mediata dall’insulina. In futuro l’identificazione delle proteine espresse tramite Spettrometria di Massa, associata ad analisi tramite Immunoblotting con anticorpi specifici, potrà contribuire a chiarire il collegamento tra SSAO/VAP-1 e la via di segnale mediata dall’insulina e a dare nuove informazioni sul ruolo di questo enzima.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Rigo, Adelio
Correlatore:Di Paolo, Maria Luisa
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 21 > Scuole per il 21simo ciclo > BIOCHIMICA E BIOTECNOLOGIE > BIOCHIMICA E BIOFISICA
Data di deposito della tesi:29 Gennaio 2009
Anno di Pubblicazione:2009
Parole chiave (italiano / inglese):Ammino Ossidasi; SSAO/VAP-1; adipociti; plasma; insulina; metilammina; stent ; cirrosi epatica; Alzheimer.
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/10 Biochimica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Chimica Biologica
Codice ID:1687
Depositato il:29 Gen 2009
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Bibliografia

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Airas L., Mikkola J., Vainio J.M., Elovaara I., Smith D.J., J. Neuroimmunol., 2006, 177, 132-135. Cerca con Google

Airenne T.T., Nymalm Y., Kidron H., Smith D.J., Pihlavisto M., Salmi M., Jalkanen S., Johnson M.S., Salminen T.A., Protein Science, 2005, 14, 1964-1974. Cerca con Google

Albericio F., Zorzano A., Marti L., Royo M., Yraola F., PCT Int. Appl., 2006, WO 2006061140. Cerca con Google

Azevedo L.C.P., M. de A. Pedro., Souza L.C., de Souza H.P., Janiszewski M., da Luz P.L., Laurindo F.R.M., Cardiovascular Research, 2000, 47, 436-445. Cerca con Google

Bairras C., Ferrand C., Atgié C., J. Physiol. Biochem., 2003, 59, 161-168. Cerca con Google

Boomsma F., Bhaggoe U.M., van der Houwen A.M.B., van den Meiracker A.H., Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1647, 48-54. Cerca con Google

Boomsma F., Hut H., Bhaggoe U., van der Houwen A., van der Meiracker A., Med Sci. Monit, 2005, 11(4):RA 122-126. Cerca con Google

Bour S., Daviaud D., Gres S., Lefort C., Prévot D., Zorzano A., Wabitsch M., Saulnier-Blache J.S., Valet P., Carpéné C., Biochimie, 2007, 89, 916-925. Cerca con Google

Bradford M. M., Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254. Cerca con Google

Brazeau B.J., Johnson B.J., Wilmot C.M., Archives of Biochemistry and Biophysics, 2004, 428, 22-31. Cerca con Google

Cantor C.R, Schimmel P.R, Biophysical Chemistry, W.H. Freeman and Company, New York, 1980, Part ?: The conformation of biological macromolecules, 279-288. Cerca con Google

Conklin D.J., Cowley H.R., Wiechman R.J., Johnson G.H., Trent M.B., Boor P.J., Am J Physiol Heart Circ. Physiol, 2004, 286, 667-676. Cerca con Google

del Mar Hernandez M. , Esteba M., Szabo P., Boada M., Unzeta M., Neuroscience Lett., 2005, 384, 183-187. Cerca con Google

Di Paolo M.L., Pesce C., Lunelli M., Scarpa M., Rigo A., Archives of Biochemistry and Biophysics, 2007, 465, 50-60. Cerca con Google

Dooley D.M., J. Biol. Inorg. Chem., 1999, 4, 1-11. Cerca con Google

Fattman C.L., Schaefer L.M., Oury T.D., Free Radical Biology & Medicine, 2003, 35, 236-256. Cerca con Google

Fersth A., Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed., W.H. Freeman and Company, New York, 1985, 306-324. Cerca con Google

Fowler C.J., Tipton K.F., Biochem Pharmacol, 1981, 30, 3329-3332. Cerca con Google

García-Vicente S., Abella A., Viguerie N., Ros-Baró A., Camps M., Testar X., Palacín M., Zorzano A., Marti L., J. Physiol. Biochem., 2005, 61, 395-402. Cerca con Google

Gorkin V.Z., Amine Oxidases in Clinical Research Pergamon Press, Oxford, 1983. Cerca con Google

Guo Honghui, Ling Wenhua, Wang Qing, Liu Chi, Hu Yan, Xia Min, Biochemical Pharmacology, 2008, 75, 1393-1401. Cerca con Google

Heider P., Wildgruber M.G., Weiss W., Berger H.J., Henning E.H., Wolf O., J. Vasc. Surg., 2006, 43, 969-977. Cerca con Google

Holt A., Degenhardt O.S., Berry P.D., Kapty J.S., Mithani S., Smith D.J., Di Paolo M.L., J. Neural Transm, 2007, DOI 10.1007/s00702-007-0680-1. Cerca con Google

Holt A., Smith D.J., Cendron L., Zanotti G., Rigo A., Di Paolo M. L., Molecular Pharmacology, 2008, 73, 525-538. Cerca con Google

Jaakkola K., Nikula T., Holopainen R., Vähäsilta T., Matikainen M.T., Laukkanen M.L., Huupponen R., Halkola L., Nieminen L., Hiltunen J., Parviainen S., Clark M.R., Knuuti J., Savunen T., Kääpä P., Voipio-Pulkki L.M., Jalkanen S., Am. J. Pathol., 2000, 157, 463-471. Cerca con Google

Jakobsson E., Nilsson J., Ogg D., Kleywegt G.J., Acta Crystallogr, 2005, D61, 1550-1562. Cerca con Google

Jalkanen S., Salmi M., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2008, 28, 18-26. Cerca con Google

Jalkanen S., Salmi M., EMBO J., 2001, 20, 3893-3901. Cerca con Google

Jalkanen S., Salmi M., Jalkanen M., PCT Int. Appl., 2005, WO2005063261. Cerca con Google

Janes S.M, Palcic M.M, Scaman C.H., Smith A.J.,Brown D.E, Dooley D.M, Mure M., Klinman J.P, Biochemistry, 1992, 31, 12147-12154. Cerca con Google

Kagan H.M., Trackman P.C., Am. J. Respir. Cell Molec. Biol., 1991, 5, 206-210. Cerca con Google

Koudelka G.B, Hansen F.B, Ettinger M.J, J.Biol.Chem. 1985, 260, 15561-15565. Cerca con Google

Kurkijarvi R., Adams D.H., Leino R., Mottonen T., Jalkanen S., Salmi M., J. Immunol., 1998, 161, 1549-1557. Cerca con Google

Leidler K. and Bunting P., The Chemical Kinetics of Enzyme Action, 2nd edn, 1973 p.p 52-53, Clarendon Press, Oxford. Cerca con Google

Lin Mao-Shin, Li Hung-yuan, Wei Jung-Nan, Lin Cheng-Hsin, Smith D.J., Vainio J., Shih Shyang-Rong, Chen Ying-Hui, Lin Lung-Chung, Kao Hsien-Li, Chuang Lee-Ming, Chen Ming-Fong, Clinical Biochemistry, 2008, doi: 10.1016/j.clinbiochem.2008.06.019. Cerca con Google

Lin Shyr-Yi, Wang Ching-Chiung, Lu Yeh-Lin, Wu Wen-Chun, Hou Wen-Chi, Food and Chemical Toxicology, 2008, 46, 2485-2492. Cerca con Google

Lunelli M., Di Paolo M.L., Biadene M., Calderone V., Battistutta R., Scarpa M., Rigo A., Zanotti G., J. Mol. Biol., 2005, 346, 991-1004. Cerca con Google

Lyles G.A., Int. J. Biochem. Cell. Bioll., 1996, 28, 259-274. Cerca con Google

Madej A., Reich A., Orda A., Szepietowski J.C., J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., 2007, 21, 72-78. Cerca con Google

Maula S.M., Salminen T., Kaitaniemi S., Nymalm Y., Smith D.J., Jalkanen S., Eur. J. Immunol., 2005, 35, 2718-2727. Cerca con Google

Morgan D.M., Biochem Soc Trans, 1985, 13, 322-326. Cerca con Google

Morin N., Lizcano J., Fontana E., Marti L., Smih F., Rouet P., Prevot D., Zorzano A., Unzeta M., Carpenè C., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2001, 297, 563-572. Cerca con Google

Morin N., Visentin V., Calise D., Marti L., Zorzano A., Testar X., Valet P., Fischer Y., Carpéné C., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002, 303, 1238-1247. Cerca con Google

Mure M., Mills S.A., Klinman J.P., Biochemistry, 2002, 41, 9269-9278. Cerca con Google

Obata T., Yamanaka Y., Neurosci. Lett., 2000, 286, 131-133. Cerca con Google

Öhman J., Jakobsson E., Källström U., Elmblad A., Ansari A., Kalderén C., Elinor R., Danielsson E., Gustavsson A.L., Varadi A., Ekblom J., Holmgren E., Doverskog M., Abrahmsén L., Nilsson J., Prot Expr Pur, 2006, 46, 321-331. Cerca con Google

Padiglia A., Medda R., Belelli A., Agostinelli E., Morpurgo L., Mondovì B., Agrò A.F., Floris G., Eur. J.Inorg.Chem., 2001, 35-42. Cerca con Google

Rigo A., Viglino P., Rotilio G., Anal. Biochem., 1975, 68, 1-8. Cerca con Google

Roessner V., Weber A., Becker A., Beck G., Frieling H., Bleich S., Eur. J. Clin. Pharmacol., 2007, 63, 425-429. Cerca con Google

Roessner V., Weber A., Becker A., Beck G., Kornhuber J., Frieling H., Bleich S., Progress in. Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry, 2006, 30, 906-909. Cerca con Google

Salmi M., Jalkanen S., Nat Rev Immunol, 2005, 5, 760-771. Cerca con Google

Salmi M., Jalkanen S., Science, 1992, 257, 1407-1409. Cerca con Google

Salmi M., Tohka S., Jalkanen S., Circ. Res., 2000, 86, 1245-1251. Cerca con Google

Schwelberger H.G., J. Neural Transm, 2007, 114, 757-762. Cerca con Google

Smith D.J., Salmi M., Bono P., Hellman J., Leu T., Jalkanen S., J. Exp. Med., 1998, 188, 17-27. Cerca con Google

Stolen C.M., Marttila-Ichihara F., Koskinen K., Yegutkin G.G., Turja R., Bono P., Skurnik M., Hanninen A., Jalkanen S., Salmi M., Immunity, 2005, 22, 105-115. Cerca con Google

Szasz T., Thakali K., Fink G.D., Watts S.W., Exp. Biol. Med., 2007, 232, 27-37. Cerca con Google

Tipton K.F, Dixon H.B, Methods Enzymol, 1979, 63, 183-234. Cerca con Google

Towbin H., Staehelin T. and Gordon J., Biochemistry (proc. Natl. Acad. Sci., USA), 1979, 76, 4350-4354. Cerca con Google

Tsuda T., J. Agric. Food Chem., 2008, 56, 642-646. Cerca con Google

Uçar G., J. Biochem, 2004, 29, 247-254. Cerca con Google

Vainio P.J., Kortekangas-Savolainen O., Mikkola J.H., Jaakkola K., Kalimo K., Jalkanen S., Veromaa T., Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2005, 96, 429-435. Cerca con Google

Valenca S.S., Bezerra F.S., Lopes A.A., Souza B.R, Cavalcante M.C.M., Lima A.L, Koats V.L.G., Porto L.C. Environ. Res., 2008, doi:10.1016/j.envres.2008.07.001. Cerca con Google

Van Dijk J., Boomsma F., Alberts G., Man in ‘t Veld A.J., Schalekamp M.A.D.H., Journal of Chromatography B, 1995, 663, 43-50. Cerca con Google

Visentin V., Prévot D., Marti L., Carpéné C., Eur. J. Pharmacol., 2003, 466, 235-243. Cerca con Google

Yraola F., Garcia-Vicente S., Fernandez-Recio J., Albericio F., Zorzano A., Marti L., Royo M., J. Med Chem., 2006, 49, 6197-6208. Cerca con Google

Yu P.H., Wright S., Fan E.H., Lun Z.R, Gubsdne-Harberle D., Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1647, 193-199. Cerca con Google

Zhou M. and Voloshina P.N., Anal. Biochem., 1997, 253, 169-174. Cerca con Google

Zorzano A., Abella A., Marti L., Carpenè C., Palacin M., Testar X., Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1647, 3-9. Cerca con Google

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