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Caccin, Paola (2009) Effects of snake neurotoxins and lipids on neurons. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

The venom of many snakes contains presynaptic neurotoxins (SPAN, snake presynaptic PLA2 neurotoxin), which are able to block neurotransmission and induce muscular paralysis.
Structural motives are conserved across toxins, but quaternary structures vary considerably; we have therefore considered four toxins characterised by different structural complexity: Notexin (monomer), ?-bungarotoxin (heterodimer), taipoxin (trimer) e textilotoxin (pentamer).
These toxins are endowed with PLA2 enzymatic activity; they hydrolyse the sn-2 ester bond of glycerophospholipids, thereby producing lysophospholipids (lysoPLs) and fatty acids.
It has been shown, by using equimolar mixtures of such lipids on isolated neuromuscular junction and on cultivated neurons, that they are able to reproduce the effects of toxins: the block of neurotransmission with alteration of the morphology of nerve terminals (depletion of synaptic vesicles (SVs), swelling, alteration of mitochondria) and the formation of bulges on neurites, characterised by accumulation of specific marker of SVs.
These findings have led to interpreting the toxin mechanism of action as driven by an imbalance between exocytosis and endocytosis, due to the different structural characteristics of the lipids being produced: the lysophosphatidylcholine (lysoPC) has an inverted-cone shape and remains in the external leaflet of the membrane; on the contrary, fatty acids have a cone shape and move fast to both leaflets of the membrane. Such alteration of the lipid composition of the membrane causes its deformation, which facilitates its fusion with the SVs (ie, it facilitates the transition between the hemifusion intermediate and the open pore) and at the same time inhibits endocytosis, which is necessary to recover empty vesicles and to maintain the functionality of the synapses.
Similar results, with regard to the block of neurotransmission, have been obtained when testing lysoPLs with different polar heads; in particular, lysoPLs with a negative charge are able, in presence of high magnesium concentrations, to induce a triphasic pattern of paralysis (initial depression followed by increment of neurotransmitter release, and finally a progressive lowering of the muscular contraction), which is considered specific to SPANs. The phenomenon can be reversed by washing with albumin, which complexes lipids and restores the equilibrium.
SPANs and their lipid products have been tested also on the neuromuscular junction of Drosophila melanogaster. In this model, however, the toxins resulted inactive. This suggests that the specific receptors, which are necessary to their action, are missing. On the contrary, the mixture of lysoPC and oleic acid (OA) causes an initial increase of their excitatory postsynaptic potential, followed by the block of neurotransmission, and the bulging of synaptic buttons. Similar to what observed on the mouse neuromuscular junction, lysoPC is the active component; its effect on the fusion of SVs is more general than that of the toxins.
Significant amounts of lysoPC were detected in the saliva of hematophagous arthropods, which are at an earlier stage of the evolution process than snakes. When used in laboratory experiments, this is sufficient to cause a range of effects which are similar to those induced by the synthetic lipids. It is therefore conceivable that such lipids represent a very simple poison obtained from digestive phospholipases, from which neurotoxins could then have evolved.
The effect on the probability of SV fusion is not sufficient to explain the extensive depletion which is observed after intoxication. The prolonged production of lysoPLs and fatty acids causes an alteration of the membrane permeability to calcium, which enters into the cell mainly from the external medium. This effect induces a massive fusion of SVs, also involving the reserve pool, and the alteration of cell metabolism, notably for what concern the mitochondria. Toxins conjugated with fluorophores are visible inside the neurons a few minutes after intoxication, and they colocalise with mitochondria. When used on preparations of isolated mitochondria, such toxins are able to promote the opening of the permeability transition pore with an efficiency which is directly proportional to their phospholipasic activity; similar results were obtained with mixtures of lysoPC and fatty acids.
Other amphipathic molecules, with different chemical structure than lysoPC, but a broadly similar inverted-cone shape, are also able to induce a reversible block of neurotransmission, the formation of bulges in the neurons and an increase in the intracellular calcium levels, with similar kinetics to lysoPC. In particular, miltefosine and perifosine (used in anti-tumoral therapies) as well as the lysolipid derived from PAF (Platelet Activated Factor) have already been tested.
The neurotoxicity of the snake phospholipases derives therefore from a high level of specificity and localisation of enzymatic activity; however, their mechanism of action is more general, as it is related to the general role of lipids in the biological membrane fusion process .

Abstract (italiano)

Il veleno di molti serpenti contiene neurotossine ad azione presinaptica (SPAN, snake presynaptic PLA2 neurotoxin) che sono in grado di provocare blocco della neurotrasmissione e paralisi muscolare. I motivi strutturali sono molto conservati, ma la struttura quaternaria è molto variabile; si sono perciò prese in considerazione quattro tossine di diversa complessità strutturale: notexin (monomero), ?-bungarotoxin (eterodimero), taipoxin (trimero) e textilotoxin (pentamero).
Queste tossine sono dotate di attività enzimatica di tipo PLA2, cioè idrolizzano il legame estereo in posizione 2 dei glicerofosfolipidi, producendo lisofosfolipidi e acidi grassi.
Utilizzando miscele equimolari di questi lipidi su giunzione neuromuscolare isolata e su neuroni in coltura si è dimostrato che essi sono in grado di riprodurre gli effetti delle tossine: blocco della neurotrasmissione con alterazione della morfologia dei terminali (deplezione delle vescicole sinaptiche, rigonfiamento, alterazione dei mitocondri) e formazione di rigonfiamenti (“bulges”) sui neuriti, caratterizzati da accumulo di proteine specifiche delle vescicole sinaptiche. Questi dati hanno portato a interpretare il meccanismo d’azione delle tossine come uno sbilanciamento tra eso ed endocitosi, dovuto alle caratteristiche strutturali dei lipidi che vengono prodotti: la lisofosfatidilcolina (lisoPC) ha forma di cono invertito e rimane confinata nel foglietto esterno della membrana, gli acidi grassi hanno forma a cono, ma si ripartiscono velocemente su entrambe i foglietti. Questa alterazione della composizione lipidica della membrana plasmatica ne provoca una deformazione che rende più facile il processo di fusione con le vescicole sinaptiche, cioè facilita la transizione tra intermedio di emifusione e poro aperto; per le stesse ragioni invece inibisce l’endocitosi, necessaria per il recupero delle vescicole stesse e il mantenimento della funzionalità della sinapsi.
Analoghi risultati di blocco della neurotrasmissione sono stati ottenuti testando lisofosfolipidi con diverse teste polari; in particolare, lisolipidi dotati di carica negativa, in presenza di alte concentrazioni di magnesio, sono in grado di provocare un andamento trifasico della paralisi (iniziale depressione, facilitazione, diminuzione progressiva della contrazione muscolare) ritenuto tipico delle SPANs. Il fenomeno è reversibile mediante lavaggio con albumina, capace di complessare i lipidi e riequilibrare la situazione.
Le SPANs e i loro prodotti lipidici sono stati testati anche sulla giunzione neuromuscolare di Drosophila melanogaster: le tossine sono risultate inattive in questo modello, suggerendo la mancanza di recettori specifici, necessari alla loro azione. La miscela di lisoPC e acido oleico provoca invece un iniziale aumento del potenziale post-sinaptico eccitatorio, seguito dal blocco della neurotrasmissione, e un rigonfiamento dei bottoni sinaptici. Analogamente a quanto osservato sulla giunzione neuromuscolare di topo, il componente attivo è la lisoPC e il suo effetto sulla fusione delle vescicole sinaptiche sembra essere di carattere generale. Anche animali meno evoluti dei serpenti, come alcuni insetti ematofagi, contengono nella loro saliva concentrazioni significative di lisoPC, sufficienti a provocare nei modelli sperimentali effetti analoghi a quelli osservati con i lipidi sintetici. E’ possibile che questi lipidi rappresentino una forma molto semplice di veleno ottenuto da fosfolipasi digestive, da cui si sono in seguito evolute le neurotossine.
L’effetto sulla fusione delle vescicole non è sufficiente a spiegare l’estensiva deplezione che si osserva dopo l’intossicazione. La prolungata produzione di lisolipidi e acidi grassi provoca un’alterazione della permeabilità della membrana allo ione calcio, che entra nella cellula principalmente dal mezzo esterno. Questo comporta una massiccia fusione delle vescicole sinaptiche, che coinvolge anche il pool di riserva, e alterazioni del metabolismo cellulare, soprattutto a carico dei mitocondri. Tossine coniugate con fluorofori sono visibili all’interno dei neuroni dopo tempi brevi di intossicazione e colocalizzano con i mitocondri. Su preparazioni di mitocondri isolati sono in grado di promuovere l’apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale con un’efficienza proporzionale alla loro attività fosfolipasica; analoghi risultati si sono ottenuti con miscele di lisoPC e acidi grassi.
Blocco reversibile della neurotrasmissione, formazione di bulges nei neuroni e aumento dei livelli intracellulari di calcio sono prodotti, con cinetiche simili a quelle della lisoPC, anche da altre molecole anfipatiche di diversa struttura chimica, ma aventi una forma complessiva di cono invertito. Tra queste sono state testate miltefosina e perifosina, usate in terapia come agenti anti-tumorali, e il lisolipide derivato dal PAF (Platelet Activated Factor).
La neurotossicità delle fosfolipasi di serpente deriva quindi da una elevata specificità e localizzazione dell’attività enzimatica; accanto a ciò è da considerare che la loro azione si esplica su un meccanismo che ha carattere più generale, cioè il ruolo dei lipidi nei processi di fusione delle membrane biologiche.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Montecucco, Cesare
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 21 > Scuole per il 21simo ciclo > BIOSCIENZE > BIOLOGIA CELLULARE
Data di deposito della tesi:30 Gennaio 2009
Anno di Pubblicazione:Gennaio 2009
Parole chiave (italiano / inglese):snake neurotoxin, phospholipase A2, neuromuscolar junction, lysophospholipids, inverted-cone shaped lipid
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/13 Biologia applicata
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali
Codice ID:1778
Depositato il:30 Gen 2009
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Bibliografia

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