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Vivona, Sandro (2009) VAMP7: a model system to study the Longin Domain-SNARE motif. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Eukaryotic cells rely on a complex system of membrane-enclosed compartments that are maintained by the trafficking of shuttling vesicles. The fusion of these vesicles with the target compartment relies on multiprotein complexes that have been conserved throughout eukaryotic evolution. SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins are considered the engine of membrane fusion in all trafficking pathways of the cell. Upon specific protein-protein interactions, SNARE proteins that are localized in opposing membranes form a four helix bundle that releases free energy and induces membrane fusion. The SNARE motif is the elementary unit of this bundle and defines all SNARE proteins.
SNARE proteins possess other regulatory domains that contribute in modulating the specificity of the fusion event. One of these accessory elements is the Longin Domain (LD). Other than being well conserved among all eukaryotes, the LD is not limited to SNAREs only and is present in many molecular processes related to the life cycle of vesicles. LD-containing SNAREs are called Longins and are divided in three main subfamilies: Ykt6p, Sec22b, VAMP7. The Longin Domain (LD) is usually composed of about 120 amino acids arranged in a globular structural fold that consists of five ? strands (?1- ?5) sandwiched by one ? helix (?1) on one side and two helices (?2 and ?3) on the other side.
The LD can fold back onto the SNARE motif in Ykt6p and Sec22b but not in Nyv1p – a fourth minor longin subfamily. This intramolecular interaction involves a surface-exposed hydrophobic pocket contributed by the ?1-?3 structural elements, which is bound by the SNARE motif. This mechanism eventually inhibits and prevents unspecific formation of the SNARE complex, thus regulating the vesicle fusion process.
However, very little is known about the dynamic properties of such mechanism. The present study uses VAMP7 as a model system to reveal these characteristics. Our interest in VAMP7 relies on the fact that not only VAMP7 lacks any direct evidence of the LD-SNARE interaction, but it also offers a system of natural variations to the usual LD-SNARE domain arrangement that can prove extremely useful in our study. The present work reveals unknown dynamic properties of the LD-SNARE interaction supporting a dominantly “closed conformation” for Longins, with heterogeneous characteristics. The results shown in this research complement well with what we already know about a similar auto-inhibitory mechanism observed in the Syntaxin subfamily of SNAREs. Therefore, we provide here new bases for a better understanding of the regulatory mechanisms involved in vesicle fusion.

Abstract (italiano)

Le cellule eucariote sono caratterizzate da un complesso sistema di membrane, che offre svariate compartimentazioni con diverse condizioni chimico-fisiche. Se da una parte tale sistema permette la realizzazione di un’ampia gamma di processi biochimici, dall’altra richiede un altrettanto complesso sistema di interscambio atto al suo mantenimento. Tale interscambio è assicurato dal trafficking di vescicole che originano da un compartimento donatore e riversano il loro contenuto in un compartimento accettore attraverso un processo che richiede la fusione delle membrane lipidiche. Tale processo si fonda sull’organizzazione di complessi macromolecolari a cui contribuiscono varie famiglie proteiche ben conservate attraverso l’evoluzione eucariotica. La famiglia delle SNARE è una di queste. Le SNAREs sono considerate i motori della fusione di membrane. La loro capacità di formare complessi specifici in trans tra le due memrane su cui risiedono fornisce il contributo energetico necessario a indurre la fusione degli strati lipidici. Tali complessi consistono in un intreccio di quattro eliche chiamate SNARE motifs, domini di circa 60-70 amino acidi che definiscono tutte le SNAREs.
Oltre allo SNARE motif, le SNAREs contengono spesso domini accessori a funzione regolativa. Uno di questi è il Longin Domain (LD). Il LD non è limitato alle sole SNAREs e anzi si ritrova in altre famiglie proteiche tutte coinvolte in processi molecolari riguardanti il ciclo vitale di una vescicola. Nelle SNAREs, il LD definisce una famiglia chiamata Longins, suddivisa a sua volta nelle proteine Ykt6, Sec22b e VAMP7. Il LD consiste di circa 120 aminoacidi organizzati in una struttura spaziale globulare che comprende un piano di cinque foglietti ? (?1- ?5), complessati da un’alfa elica (?1) su un lato e da altre due eliche (?2-?3) sull’altro.
In Ykt6 e Sec22b si è dimostrata la possibilità che il LD si ripieghi sullo SNARE motif e lo coordini su una sua superficie idrofobica compresa tra ?1 e ?3. Questo meccanismo si è dimostrato in grado di prevenire la formazione di complessi SNARE non specifici. Tuttavia ben poco si conosce ad oggi sulla natura di questa interazione in termini dinamici, a differenza di quanto invece si sa per un analogo meccanismo osservato nella famiglia SNARE delle Sintaxine. In altri temrini non è dato sapere se nelle Longine questo meccanismo implica una conformazione stabilmente “chiusa” di LD e SNARE, o se piuttosto esso si realizza come un equilibrio dinamico tra conformazioni aperte e chiuse. Una serie di motivi, tra cui l’assenza di dati diretti per questo fenomeno in VAMP7 e la possibilità di usufruire di sue varianti naturali, ci hanno spinto a scegliere VAMP7 come sistema modello per fornire le risposte ai suddetti interrogativi.
I nostri dati suggeriscono per le Longine una conformazione stabilmente chiusa, ma non omogenea e capace di cambi conformazionali molto rapidi. Questo lavoro complementa bene quanto già noto per le sintaxine e fornisce dunque la possibilità di comprendere meglio i meccanismi regolativi gneralmente adottati nella fusione vescicolare.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Filippini, Francesco
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 21 > Scuole per il 21simo ciclo > BIOCHIMICA E BIOTECNOLOGIE > BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:01 Febbraio 2009
Anno di Pubblicazione:01 Febbraio 2009
Parole chiave (italiano / inglese):trafficking vesicle longin domain SNARE fusion dynamic NMR interaction X-ray crystallography light scattering nuclear magnetic resonance HSQC backbone assignment membrane VAMP7
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:1887
Depositato il:01 Feb 2009
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Bibliografia

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