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Carnio, Silvia (2009) Cell therapy for muscular dystrophies: in vivo delivery of myogenic precursor cells via biocompatible scaffolds. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is characterized by mutations in the dystrophin gene, which lead to the absence of a functional protein and consequent muscle fibers degeneration and necrosis. In dystrophic muscles, the regenerative potential of endogenous satellite cells (the muscle resident stem cell population) is exhausted due to repeated degeneration-regeneration cycles and affected muscle tissue is progressively replaced by fibrotic connective tissue and fat.
No effective therapy is available for DMD patients yet, despite years of ongoing research on gene- and cell-based therapies. Cell therapy is aimed at delivering dystrophin-expressing cells into dystrophic muscle, in order to generate new, non-defective fibers and, most importantly, to replenish the endogenous stem cell pool. This way, during the ongoing regeneration processes non-diseased delivered satellite cells would generate healthy muscle fibers that would eventually replace the defective ones. Last but not least, once developed an effective cell-therapy protocol for DMD could be immediately applied to the many others monogenic forms of inherited muscular dystrophies.
At present, cell therapy is still suffering from several problems, which can be summarized in two main points: the identification of the best-suited type of myogenic cell and its efficient delivery into the diseased muscles. Several studies have clearly demonstrated that the use of biomaterials can improve cell delivery in vivo; in particular our group has first demonstrated its potential in specifically delivering myogenic cells into regenerating skeletal muscle. The design of biomaterials for cell-delivery purposes involves several challenging aspects, as the biomaterial should appropriately mimic the recipient tissue in vivo and, in the case of stem cells, behave as an artificial niche capable of preserving the proliferative and differentiative potential of the implanted cells.
In this work two different types of biomaterials were explored as potential vehicles to perform cell delivery in the muscles of the murine model for DMD (mdx strain). This work has been carried out in close collaboration with the Biological Engineering Research and Application laboratory at Chemical Engineering Department of University of Padova.
Initially, a three-dimensional collagen sponge was investigated as a cell reservoir to accomplish long-term cell delivery in dystrophic muscles. Collagen sponge is a three-dimensional scaffold, natural and highly elastic, whose architecture is suitable to host high numbers of mononucleated cells inside. In this series of experiments, collagen scaffolds were used to deliver high numbers of in vitro expanded myogenic precursor cells. Scaffold features were first evaluated in vitro and then its performance as a cell carrier was analyzed in vivo, both wt and mdx mice. Our data showed that cellularized collagen scaffolds did behave as a cell reservoir, releasing cells in the muscle while it was degraded in vivo. However, the general efficiency of this approach, measured as number of dystrophin-positive fibers formed in the transplanted muscles, was too low to be of clinical interest.
For this reason, we decided to work with a different cell/biomaterial combination. In particular, we moved from in vitro expanded myogenic precursors to freshly isolated satellite cells and from collagen sponges to a hyaluronic-based hydrogel. This latter is a novel, natural injectable polymer, polymerizable in situ, which can moreover be produced through fermentative process and therefore easily prepared in clinical grade immediately. Hydrogel mechanical and elastic properties were characterized and conditions to encapsulate cells into the polymer were set up for both in vitro cultures and in vivo transplantation. Therefore, freshly isolated satellite cells were encapsulated into hydrogel and delivered into tibialis anterior muscles of both wt and mdx mice in order to analyze hydrogel efficiency as a cell carrier in vivo. Hydrogel-encapsulated cells yielded very good regeneration in wt mice, with many new fibers derived from donor cells. However, so far these promising results did not translate into such an efficient dystrophin delivery into the mdx model. These experimental observations are fundamental to develop a suitable combination of hydrogel and stem cells in order to face the different physiological conditions existing between the wt and the dystrophic muscle (e.g., its chronic state of inflammation).

The first chapter will give an overview of the main issues concerning myogenic cell transplantation. It will introduce muscle-resident satellite cells and the pathologic state of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). Then therapeutical approaches for DMD are discussed, with particular attention to cell therapy and cell-delivery aspect; to this end the use of biomaterials is discussed as an alternative to face cell delivery issue, in order to finally introduce the aim of this work.
The second chapter will describe the use of three-dimensional collagen sponge as a vehicle to perform cell delivery into dystrophic muscles.
Chapter 3 will present the injectable hyaluronic-based hydrogel and its potentialities as a cell carrier in vivo. Finally, general conclusions of the work are given.


Abstract (italiano)

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è caratterizzata da mutazioni nel gene della distrofina, che portano all’assenza di una proteina funzionale, con conseguente degenerazione e necrosi delle fibre muscolari. Nei muscoli distrofici, il potenziale rigenerativo delle cellule satelliti endogene, (la popolazione staminale del muscolo) è esaurito a causa dei continui cicli di degenerazione-rigenerazione che il muscolo distrofico subisce, per cui il tessuto muscolare viene con il tempo rimpiazzato da grasso e da tessuto fibrotico. Al momento, nonostante l’ assidua ricerca di una terapia di tipo genico o cellulare, non esiste una terapia efficace per i pazienti DMD.
Lo scopo di una terapia cellulare è quello di rilasciare cellule che esprimono distrofina all’interno di un muscolo distrofico, al fine di rigenerare nuove fibre muscolari, non difettive per ‘espressione della proteina, e, più importante, al fine di reintegrare il pool di cellule satelliti endogene. In questo modo, durante la rigenerazione, le cellule rilasciate che esprimono distrofina, andrebbero a formare nuove fibre muscolari non difettive per l’espressione della proteina che con il tempo, andrebbero idealmente a sostituire, almeno in parte, quelle difettive. Infine, un’importante caratteristica di una terapia di tipo cellulare è che, una volta messo a punto un protocollo per una terapia efficace in pazienti DMD, questa potrebbe essere subito applicata ad altre distrofie di tipo monogenico.
Al momento una terapia di tipo cellulare presenta diversi problemi che possono essere raggruppati in due punti principali: l’identificazione del miglior precursore miogenico da rilasciare e il modo con cui esso è rilasciato all’interno del muscolo malato al fine di un efficiente risultato. Diversi lavori hanno già dimostrato che l’utilizzo di biomateriali in questo campo può migliorare l’efficienza di rilascio in vivo. In particolare il mio gruppo ha già dimostrato queste potenzialità, utilizzando cellule miogeniche rilasciate nel muscolo rigenerante attraverso diversi tipi di biomateriali.
La realizzazione di biomateriali per il rilascio di cellule implica diverse difficoltà, perché un biomateriale dovrebbe idealmente mimare il tessuto nel quale dovrà effettuare rilascio di cellule, e ricreare una nicchia per le cellule rilasciate, in grado cioè di preservarne le potenzialità proliferative e differenziative.
In questo lavoro si sono trattati due diversi tipi di biomateriali, con modalità differenti, ma con lo scopo comune di effettuare un efficiente rilascio di cellule (e quindi di distrofina) nel topo mdx (modello murino per i pazienti DMD). Questo lavoro è stato condotto in stretta collaborazione con il laboratorio BioERA. (Biological Engineering Research and Application) presso il Dipartimento di Ingegneria Chimica dell’università degli studi di Padova.
Inizialmente si è utilizzata una spugna tri-dimensionale in collagene, altamente elastica e la cui struttura è adatta a contenere un elevato numero di cellule mononucleate al suo interno, da essere rilasciate nel lungo termine all’interno del muscolo distrofico. In questa serie di esperimenti, scaffolds di collagene sono stati utilizzati per rilasciare in vivo un elevato numero di precursori miogenici precedentemente espansi in coltura.
Le proprietà e le caratteristiche dello scaffold sono state analizzate prima in vitro e successivamente in vivo, sia in modelli sani wt che distrofici mdx, per valutarne le potenzialità come mediatore di rilascio cellulare. I nostri dati mostrano che lo scaffold di collagene ha effettivamente agito come un serbatoio cellulare, rilasciando le cellule che conteneva, mentre veniva degradato in vivo. Tuttavia però, il grado di efficienza generale di questa combinazione di cellule e biomateriale, quantificata come numero di fibre distrofina positive formatosi nei muscolo impiantati, era troppo bassa per avere una rilevanza clinica. Per questo motivo è stata proposta una alternativa che utilizza cellule satelliti isolate a fresco al posto di mioblasti espansi in vitro, e come biomateriale un hydrogel derivato dell’acido ialuronico al posto delle spugne in collagene.
Quest’ultimo in particolare è un biomateriale iniettabile, di nuova realizzazione che viene reticolato in situ;l’acido ialuronico inoltre può essere prodotto per mezzo di processi fermentativi, caratteristica per la quale questo hydrogel può essere facilmente preparato per applicazioni di tipo clinico.
Le proprietà meccaniche ed elastiche dell’hydrogel, così come le condizioni migliori per l’incapsulamento di cellule all’interno sono state caratterizzate sia in colture in vitro che per le applicazioni in vivo. Quindi, cellule satelliti isolate a fresco sono state incapsulate dentro l’hydrogel e rilasciate in vivo in muscoli tibiali anteriori di topi sia wt che distrofici mdx, al fine di valutare l’efficienza di rilascio di cellule da parte dell’hydrogel in vivo. Le cellule sospese in hydrogel hanno indotto una ampia rigenerazione in topi wt dove si sono osservate molte fibre derivanti dalle cellule donatrici rilasciate. L’efficienza di questi risultati tuttavia, non si è ripetuta quando lo stesso approccio è stato usato per ottenere rilascio di distrofina nel modello mdx.
Questi dati pongono i presupposti per sviluppare una combinazione di hydrogel e staminali ad hoc per le diverse condizioni fisiologiche tra ambiente wt e distrofico (caratterizzato da infiammazione cronica).

Il primo capitolo presenterà una panoramica dei principali problemi riguardanti il rilascio di cellule miogeniche in vivo. Introdurrà quindi le cellule satellite e lo stato patologico della distrofia muscolare di Duchenne; in seguito vengono descritti gli approcci terapeutici per questo tipo di distrofina, con particolare attenzione a una terapia di tipo cellulare e al modo in cui le cellule vengono rilasciate in vivo. A questo proposito l’utilizzo di biomateriali si pone come possibile alternativa per la risoluzione del problema del rilascio in vivo. Successivamente viene descritto lo scopo della tesi.
Il secondo capitolo descriverà l’utilizzo di uno scaffold tri-dimensionale di collagene come mediatore per rilascio di cellule in vivo.
Il capitolo 3 invece descriverà l’utilizzo di un hydrogel derivato dall’acido ialuronico per lo stesso fine. Nella parte finale infine, sono riportate le conclusioni di tutto il lavoro.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Vitiello, Libero
Correlatore:Elvassore, Nicola
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 21 > Scuole per il 21simo ciclo > BIOSCIENZE > GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE DELLO SVILUPPO
Data di deposito della tesi:02 Febbraio 2009
Anno di Pubblicazione:02 Febbraio 2009
Parole chiave (italiano / inglese):CELL-THERAPY, CELL-DELIVERY, MYOGENIC PRECURSOR CELLS, SATELLITE CELLS, MUSCULAR DYSTROPHY, TISSUE ENGINEERING, BIOMATERIALS, COLLAGEN SCAFFOLD, HYDROGEL
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/34 Medicina fisica e riabilitativa
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:1948
Depositato il:02 Feb 2009
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Bibliografia

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1. Bach AD, Beier JP, Stern-Staeter J, et al. Skeletal muscle tissue engineering. Journal of Cell. Mol. Med 2004; 8: 413-422. Cerca con Google

2. Deasy B, Li Y and Huard J. Tissue engineering with muscle-derived stem cells. Current Opinion in Biotechnology 2004; 15: 419–423. Cerca con Google

3. Menaschè P. Skeletal myoblast for cell therapy. Cor Art Dis 2005; 16: 106-110. Cerca con Google

4. Urish K KY, Huard J. Initial failure in myoblast transplantation therapy has led the way toward the isolation of muscle stem cells: potential for tissue regeneration. Current Topics in Developmental Biology 2005; 68: 263-280. Cerca con Google

5. Levenberg S, Rouwkema J, Macdonald M, et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology 2005; 23: 821-823. Cerca con Google

6. Machida S, Spangenburg E and Booth F. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Prolif 2004; 37: Cerca con Google

7. Montarras D, Morgan J, Collins C, et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science 2005; 309: 2064-2067. Cerca con Google

8. Freed LE and Vunjak-Novakovic G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews 1998; 33: 15-30. Cerca con Google

9. Powell K. Stem-cell niches: it's the ecology, stupid! Nature 2005; 435: 268-270. Cerca con Google

10. Stern-Straeter J, Bach A, Stangenberg L, et al. Impact of electrical stimulation on three dimensional myoblast cultures – a real-time RT-PCR study. J. Cell. Mol. Med 2005; 9: 883-892. Cerca con Google

11. Radisic M, Park H, Shing H, et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101: 18129-18134. Cerca con Google

12. Partridge TA. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Therapy 2002; 9: 752-753. Cerca con Google

13. Zhang S, Gelain F and Zhao X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cultures. Seminars in Cancer biology 2005; 15: 413-420. Cerca con Google

14. Pedrotty D, Koh J, Davis B, et al. Engineering skeletal myoblasts: role of 3D culture and electrical stimulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 288: H1620-H1626. Cerca con Google

15. Cimetta E, Flaibani M, Mella M, et al. 3D culture of muscle precursors stem cells in a perfusion bioreactor. International Journal of Artificial Organs 2007; 30: 415- 428. Cerca con Google

16. Flaibani M, Boldrin L, Cimetta E, et al. Muscle precursor cells differentiation and myotubes alignment by micro-patterned surfaces and exogenous electrical stimulation. submitted; Cerca con Google

17. Hill E, Boontheekul T and Mooney D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 2494-2499. Cerca con Google

18. McCaig C, Rajnicek A, Song B, et al. Controlling cell behaviour electrically: current views and future potential. Physiol Rev 2005; 85: 943-978. Cerca con Google

19. Naumann K and Pette D. Effects of cronic stimulation with different impulse patterns on the expression of myosin isoforms in rat myotubes cultures. Differentiation 1994; 55: 203-211. Cerca con Google

20. P De Coppi, S Bellini, M Conconi, et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng 2006; 12: 1929-1936 Cerca con Google

21. Boldrin L, Elvassore N, Malerba A, et al. Satellite cells delivered by micro-patterned scaffolds: a new strategy for cell trasplantation in muscle diseases. Tissue Engineering 2007; 13: 253-262. Cerca con Google

22. Cannizzaro C, Tandon N, Figallo E, et al. Practical aspects of cardiac tissue engineering with electrical stimulation. Methods in molecular medicine: Tissue engineering, 2007. Cerca con Google

23. Wozniak A and Anderson J. Nitric Oxide-Dependence of Satellite Stem Cell Activation and Quiescence on Normal Skeletal Muscle Fibers. Developmental Dynamics 2007; 136: 240-250. Cerca con Google

24. Zhang J, Kraus W and Truskey G. Strech induced mitric oxide modulates mechanical properties of skeletal muscle cells. Am J Physiol 2004; 287: 292-299. Cerca con Google

25. Borschel GH, Dennis RG and Kuzon WM. Contractile skeletal muscle tissueengineered on an acellular scaffold. Plast Reconstr Surg 2004; 113: 595-602. Cerca con Google

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