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Suglia, Irene (2009) :Valutazione dell'effetto chiarificante e della potenziale allergenicità di proteine di origine vegetale in vino rosso. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Wine transmits sensations that are expressive of a history which is dependent on its origin and cultivation methods.
Clarification, one of the main winemaking operations, is used to make the wine clean and stable by adding proteins with absorbent power that interact with colloids, which are responsible for turbidity and wine instability.
Whichever method is used, clarification improves the appearance and taste of wine. It decreases astringency by lowering the concentration of tannins concentration and stabilizes the colour of red wine.
In the field of clarifying agents, animal gelatine is the most used because of its efficiency, usefulness and low cost.
This capacity to interact with colloids and wine tannins is made by the physical- chemical properties of this animal substance.
The use of bovine gelatine in enology has already been abandoned, since 1997, as a precaution, Reg.CE n. 2087/97, after the outbreak of BSE (Bovine spongiform encephalopathy) which can cause a human degenerative pathology of the central system of the brain called Creutzfeldt Jacob disease.
The diffusion of this pathology has resulted in particular attention in the use of animal protein adjuvant and has stimulated new studies of clarifying agents derived from different sources.
The research in this field is focused firstly on wheat proteins (gliadins and glutenins) which could be used in the winemaking process, because of the way they interact (also at low concentration) with phenolic compounds and tannins forming a stable and insoluble complex.
Wheat gluten is composed of a prolamin fraction called gliadin which is rich in proline, and useful for the absorption of polyphenols.
The amino acid composition of proteins play an important role in the polyphenols’ absorption through the formation of stable compounds; moreover it is already known that proteins rich in proline are able to bind tannin compounds more strongly.
During my PhD program I have focused my studies on the characterisation of new vegetable clarifying agents, like wheat proteins, corn and legume proteins to evaluate the technological efficiency in red wine, protein residuals in treated wines and their allergic properties.
At the beginning vegetable clarifying agents already permitted by Reg. CE 2165/2005 were taken into account and the study was planned as follow:
1. Retail (commercial) products are being bought (Gluvital 21000, GBS-P51, ProGel 21110, Isolated gluten, Corn Gluten, SoyPro 900, bean CV4, peas ProFlo, and Farilup); wheat and corn protein extracts are being produced in our laboratory. Moreover conventional clarifying agents, like gelatine, egg albumin, caseinate, were used as a comparison in our experimental tests.
2. All samples were analysed with chemical and physical assays; the protein content of each sample was evaluated which allowed us to find the degree of purity of our clarifying agents.
3. The qualitative evaluation of protein patterns was carried out using SDS-PAGE analysis and has showed different protein molecular weights of our clarifying agents.
4. Policlonal antibodies (able to bind protein clarifying agents) were used; these being anti-gliadin, anti-High molecular weigh glutenin subunits, anti-HMW-LMW glutenin subunits, anti-egg albumin, anti-soy, anti-legume.
5. These polyclonal antibodies (above) were checked to determine their clarifying agent’s specificity as a background in order to carry out experimental tests focused on the research of allergenic residual proteins in wine.
6. The water and hydro-alcoholic solubility of each clarifying agent has been evaluated (12% ethanol, pH 3.5) to determine any potential allergenic risk. Our tests have shown better solubility of hydrolysed clarifying proteins when using a hydro-alcoholic solution.
7. We had evaluated the solubility of each clarifying agent in a hydro-alcoholic solution (12% ethanol, pH 3.5) containing tannins in increased concentration (0.1-0.5-1-2-4 g/L). Using this method it was shown that an increase in tannins solution caused an increase of the precipitate formed by interaction between tannins and proteins with a consequent decrease in clarifying agent residual in solution.
8. For each sample the technological quality (decrease of turbidity and phenolic compounds) was evaluated. We have carried out some micro-clarification with young red wine, Merlot and Merlot/Cabernet cultivar (2005/2007) by using conventional clarifying agents (like gelatine and egg albumin) and corn, wheat proteins. Our results have shown that vegetable proteins work as well as conventional clarifying proteins. Moreover vegetable proteins cause a decrease of turbidity and tannins and they act less strongly on antocianin compounds that are responsible for the colour of red wine. These results led us to the conclusion that some vegetable proteins should be used as clarifying agents.

These proteins can be very useful in winemaking operations but they also can act as potential allergens if they’re still in wine.
The European Food Safety Authority (EFSA) have proposed a risk assessment of these new clarifying agents and have also enacted some regulations about food labelling (Dir. 68/2007/CE) integration the appendix 3 bis Dir. 13/2000/CE that lists food allergens. Present in this list are gluten and derived products, egg and egg based products, fish and fish products based, milk and milk products based, dioxide sulphites and sulphur at 10 mg/L highest concentration.
As some paper described we had analysed these clarifying agents: egg albumin, wheat gluten and legume proteins (Weber et al., 2007; Rolland et al., 2008).
9. Four different protein assays were evaluated (TCA method, Ethanol precipitation, Acetone precipitation and KDS) in order to find the most efficient. Our results show that KDS precipitation allows us to understand wine protein patterns better.
10. Micro-clarification was made with different amounts of clarifying agents (up to more than the legal quantity permitted, 50g/hL), to evaluate the minimum protein concentration detectable by using specific antibodies.
11. Moreover we are carrying out immunological tests with commercial wine treated with egg albumin for a more sensitive detection of residual proteins in wine.

As described by Weber et al., 2007 the amount of clarifying agent used in winemaking operations, less than 50 g/hL, is not detectable in the wine (with immunoenzymatic and biochemical analysis); however, when using the highest amount , all clarifying proteins seem to be detectable.
As found by our research, vegetable proteins could be good clarifying agents; they have a technological efficiency as well as conventional proteins, but sometimes they could give a potential allergenic risk.
Corn prolammins protein could be an interesting proposition in the winemaking operation and free from risk, incidently, they aren’t allergenic and so they are not listed in the appendix 3 bis.
For this reason wine treated with this product may not be listed

Abstract (italian)

Le sensazioni che il vino riesce a trasmettere sono l’espressione ultima della sua storia: sono il risultato della sua origine (vitigno, terroir) ma anche dei trattamenti ai quali è stato sottoposto.
La chiarifica è una delle operazioni enologiche con le quali si cerca di rendere il vino limpido e stabile nel tempo, aggiungendo sostanze di natura proteica ad azione assorbente che interagiscono con il materiale colloidale responsabile della torbidità e dell’instabilità. Inoltre la chiarifica migliora le caratteristiche organolettiche del vino, ne riduce l’astringenza, abbassando la concentrazione in tannini e stabilizza il colore dei vini rossi.
Tra i vari agenti chiarificanti, le gelatine di origine animale sono sicuramente le più utilizzate ed apprezzate per l’efficacia, la praticità d’uso ed il basso costo. La loro capacità di interagire con i colloidi e con i tannini del vino è sostanzialmente dovuta alle caratteristiche chimico-fisiche di questi derivati del collagene animale.
L’impiego delle gelatine bovine in enologia è stato abbandonato, in via precauzionale (Reg. C.E n.2087/97), a partire dal 1997 in seguito alla diffusione dell’encefalopatia spongiforme bovina (BSE) che provoca nell’uomo una patologia degenerativa del sistema nervoso centrale nota come malattia di Creutzfeldt-Jakob. Il diffondersi di questa malattia ha posto interrogativi relativamente all’impiego di coadiuvanti proteici di origine animale ed ha stimolato lo studio e la messa a punto di valide alternative che consentano l’impiego di sostanze chiarificanti di diversa origine.
L’attenzione degli studiosi si è focalizzata, in un primo momento, sulle proteine del frumento (gliadine e glutenine) che risultano essere particolarmente interessanti per gli impieghi enologici in quanto interagiscono anche a basse concentrazioni con i composti polifenolici e con i tannini formando complessi stabili ed insolubili. Il glutine di frumento possiede una frazione “prolamminica” denominata gliadina che è ricca di prolina che lo rende più affine ai polifenoli. È noto che la composizione amminoacidica delle proteine svolge un ruolo importante nel determinare l’affinità con i composti polifenolici presenti in mosti e vini per formare complessi stabili, ed è dimostrato che le proteine ricche nell’amminoacido prolina riescono ad instaurare legami più stabili con le sostanze tanniniche.
È in questo ambito che si inserisce il progetto di ricerca del mio dottorato il cui obiettivo è la caratterizzazione di nuovi chiarificanti di origine vegetale come proteine del frumento, del mais e delle leguminose al fine di valutarne: la loro efficacia tecnologica in vini rossi, la presenza di loro eventuali residui nei vini trattati e la potenziale allergenicità delle proteine che eventualmente residuano.
Inizialmente si sono presi in considerazione chiarificanti proteici di origine vegetale il cui uso è stato recentemente consentito dal regolamento C.E. 2165/2005. Pertanto:
1. Abbiamo reperito prodotti commerciali a base di glutine di frumento (Gluvital 21000, GBS-P51, Pro*gel 21110, Glutine isolato), proteine del mais (Corn gluten) e di leguminose (Soy*Pro900, fagiolo CV4, pisello ProFlo e Farilup). Estratti proteici di frumento e di mais sono stati anche da noi prodotti in laboratorio. Inoltre chiarificanti convenzionali tipo gelatine, albumina d’uovo e caseinati sono stati utilizzati come confronto nelle prove sperimentali.
2. Tutti i campioni sono stati caratterizzati dal punto di vista chimico e fisico. In particolare è stato determinato il contenuto proteico totale di ciascun campione che ci ha permesso di valutare il loro grado di purezza.
3. È stata effettuata una valutazione qualitativa tramite SDS-PAGE che ha evidenziato nei pattern proteici ottenuti una differente distribuzione in termini di peso molecolare dei diversi campioni.
4. Sono stati reperiti anticorpi policlonali contro i chiarificanti proteici oggetto di studio (anti-gliadina, anti-High molecular weight glutenin subunit, anti-HMW-LMW-glutenin subunit, anti-egg albumin, anti-soy, anti-leguminose).
5. Sono stati saggiati i suddetti anticorpi per verificare la loro specificità nei confronti dei chiarificanti proteici oggetto del nostro studio, allo scopo di utilizzarli in una fase successiva relativamente alla ricerca di loro potenziali residui nel vino.
6. È stata valutata la solubilità di ciascun chiarificante proteico sia in acqua che in soluzione idroalcolica (12% etanolo, pH 3.5) per valutare il rischio di trovare dei loro residui in soluzione. Le prove eseguite hanno evidenziato una migliore solubilità in soluzione idroalcolica delle proteine chiarificanti che hanno subito un trattamento di idrolisi.
7. È stata valutata la solubilità di ciascun chiarificante proteico in soluzione idroalcolica (12% etanolo, pH 3.5) contenente concentrazioni crescenti di tannini (0,1-0,5-1-2-4 g/L) per valutare il rischio di trovare dei loro residui in soluzione in seguito all’aggiunta delle sostanze (tannini) che da queste proteine dovrebbero essere rimosse. In questo modo è stato verificato che all’aumentare della concentrazione di tannini in soluzione incrementava il precipitato costituito dall’interazione tannini-proteine con conseguente riduzione dei residui di chiarificante in soluzione.
8. Per ciascun campione è stata verificata l’efficacia tecnologica, intesa come riduzione della torbidità e abbattimento della componente polifenolica (in particolare proantocianidine e antociani). A questo proposito sono state allestite prove di microchiarificazione su vino rosso giovane, cultivar Merlot e Merlot/Cabernet (vendemmia 2005 e 2007) utiizzando chiarificanti convenzionalmente utilizzati in enologia (gelatine e albumina d’uovo) ed estratti proteici da mais e da frumento. I risultati ottenuti hanno evidenziato che gli estratti proteici vegetali hanno una efficacia chiarificante simile a quella delle proteine convenzionalmente utilizzate. È stato verificato infatti che le proteine vegetali abbattono in modo efficiente la torbidità e la componente tannica responsabile dell’astringenza di vari vini rossi ma abbattono solo in parte la componente antocianinica, frazione polifenolica responsabile della colorazione del vino, rispetto alle proteine animali. Questo risultato, supportato dai dati presenti in letteratura (Restani et al., 2002; Maury et al., 2003; Marchal et al., 2002), permette di ipotizzare un utilizzo tecnologico di questi prodotti come coadiuvanti enologici.

Se da un lato queste proteine possono rappresentare dei potenziali chiarificanti del vino, dall’altro richiamano il problema della sicurezza alimentare in particolare per quanto riguarda la possibilità di queste proteine di permanere nel vino e costituire un rischio allergenico.
L’Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA) ha proposto una valutazione del rischio da cui sono scaturite una serie di direttive legate all’etichettatura, l’ultima delle quali prende in considerazione anche il vino ed i chiarificanti utilizzati nel processo enologico (Direttiva 68/2007/ CE), integrando l’allegato III bis della direttiva 13/2000/CE che elenca gli alimenti allergenici. Tra le sostanze presenti in tale lista e che sono di interesse enologico si trovano i cereali contenenti glutine e prodotti derivati, uova e prodotti a base di uova, pesce e prodotti a base di pesce, latte e prodotti a base di latte, anidride solforosa e solfiti in concentrazione superiore a 10 mg/l.
Alla luce della normativa vigente e dei dati presenti in letteratura (Weber et al., 2007; Rolland et al., 2008), i chiarificanti da noi testati a questo scopo sono stati l’albumina d’uovo, i glutini di frumento e le proteine delle leguminose.
9. Sono stati valutati quattro diversi metodi (TCA, Etanolo, Acetone e KDS) per la concentrazione delle proteine nel vino chiarificato allo scopo di trovare quello più efficace. I risultati ottenuti hanno evidenziato che il metodo ottimale per la concentrazione delle proteine del vino è quello eseguito con KDS.
10. Sono state eseguite delle microchiarificazioni con concentrazioni di chiarificante, gelatine animali, albumina d’uovo e glutini di frumento, fino a 6 volte maggiori di quella massima consentita per legge (50 g/hL) per poter evidenziare la concentrazione minima oltre la quale sono rilevabili eventuali residui proteici attraverso l’uso di anticorpi specifici.
11. Infine si sono valutati attraverso prove immunologiche eventuali residui proteici presenti i microquantità in vini commerciali chiarificati con albumina d’uovo e caseinati.

Come dimostrato anche da Weber et al., quantità di chiarificante inferiore a 50 g/hL sembrano non residuare nel nostro vino, almeno uilizzando metodi immnoenzimatici e/o immunochemoluminescenti di rilevazione, mentre a valori di concentrazione di chiarificante superiori al suddetto limite, tutti i chiarificanti testati sembrano residuare nel vino.
Concludendo, da un punto di vista tecnologico, le proteine vegetali prese in considerazione potrebbero essere dei buoni agenti enologici di chiarifica dato che dalla sperimentazione è emerso che loro efficacia chiarificante risulta paragonabile a quella delle proteine convenzionali, ma in alcuni casi potrebbero rappresentare un rischio dal punto di vista allergologico.
Solo l’utilizzo di prolammine del mais come chiarificante sembra essere auspicabile in quanto questa famiglia di cereali non rientra nell’allegato III bis ed è considerata non allergenica, quindi esente dall’ obbligo di etichettatura.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Pasini, Gabriella
Ph.D. course:Ciclo 21 > Scuole per il 21simo ciclo > TERRITORIO, AMBIENTE, RISORSE E SALUTE > MEDICINA AMBIENTALE: NUTRIZIONE E INQUINAMENTO
Data di deposito della tesi:UNSPECIFIED
Anno di Pubblicazione:31 July 2009
Key Words:Allergy, wine, vegetal proteins
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/15 Scienze e tecnologie alimentari
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Biotecnologie Agrarie
Codice ID:2127
Depositato il:04 Nov 2010 11:20
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Bibliografia

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