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Urbani, Luca (2010) STUDIO DEGLI EFFETTI CITOTOSSICI E ANTIANGIOGENICI DI DERIVATI 4-AMINOCHINAZOLINICI E
FENIL-PIRROLOCHINOLINONICI.
[Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

This work focused on the evaluation for cytotoxic activity and in vitro and in vivo anti-angiogenic effects of two new synthetic compound classes: the tirosine kinase inhibitors (TKIs) 4-anilinoquinazoline, against EGFR, and microtubule-affecting pyrroloazaflavone compounds named phenyl-pyrroloquinolinones.
The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a trans-membrane receptor tyrosine kinase that belongs to the ErbB family of receptors. EGFR dimerization results in the induction of intracellular protein-tyrosine kinase activity leading to signal transduction pathways that regulate cell differentiation, growth, migration, and apoptosis. EGFR is constitutively expressed by many cell types, such as epithelial cells. EGFR is often mutated and/or overexpressed in many tumors. EGFR dysregulated signaling leads to abnormal cell proliferation, invasion of surrounding tissues, and increased angiogenesis. Therefore, EGFR represents a valuable target for the design of anticancer agents. Indeed, several strategies have been explored to target EGFR and tirosine kinase inhibitors (TKIs) seem to be the most promising approaches. TKIs link the ATP-binding pocket of the cytoplasmic domain to inhibit EGFR phosphorylation. The tumor growth depends on vascularization and subsequently it can be inhibited by a strictly control of neo-vessel formation inside the tumor mass. It is known that the pharmacological inhibition of EGFR can decrease VEGF expression and consequently angiogenesis in many tumor types. Thus, several inhibitors of both EGFR and VEGFR have been designed and studied. In this context, anti-proliferative activity of 6,7-ethylene(methylen, propylenen) diossi-N-(3-phenyl)-4-amino quinazolines, bearing various substituents at 3’ position of the phenyl group, in analogy of the EGFR-specific TKIs PD153035 and Vandetanib, was assessed on A431 and NIH3T3 cells, overexpressing and not expressing EGFR, respectively. The results obtained showed that ethylenedioxy derivatives were more cytotoxic than the corresponding methylendioxy and propylendioxy ones also with a strong increase in the apoptotic rate when compared to not treated cultured. On the other hand, all compounds exert a quite similar effect on EGFR phosphorylation. The presence of non polar groups at 3’ position of the phenyl group enhanced the antiproliferative activity. Indeed, compounds bearing methyl or trifluoromethyl groups at 3’ position appeared more active than those substituted with 2 halogen atoms. Since the 4-aniline group interacts with a hydrophobic pocket of EGFR, we can suppose that the presence of non polar groups improves the interaction with this site leading to an increase in the affinity towards EGFR. As a confirmation of these considerations, substituting the bromine atom with functional groups possessing high lipophilia and steric hindrance, like a phenylic group, lead to an anti-proliferative effect that remains also after removal from the culture media. Moreover, the ethylendioxy derivatives with phenylic group at 3’ position also shows potent anti-angiogenic effects on in vitro assays with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Indeed, more than reference compounds, these derivates affect all the angiogenic process phases, such as cell proliferation and migration and capillary-like tubular formation on Matrigel, also after pro-angiogenic modulators stimulation. Finally, unlike PD153035, ethylendioxy phenylic compounds decrease in vivo angiogenesis, blocking capillary formation on Matrigel plug assays.

Small molecular drugs that induce extensive necrosis in tumour as a result of vascular collapse, including flavonoids and tubulin polymerzating/binding agents, represent examples of vascular targeting agents. The main mechanism of action of tubulin binding agents is believe to be the selective disruption of the cytoskeleton of proliferating endothelial cells that results in tumor vessel occlusion and extensive necrosis. The aim of the present work is to investigate whether microtubule-affecting pyrroloazaflavone compounds, new tricycle structures, as modified flavones, known naturally occurring biologically active compounds, were able to provoke anti-angiogenic effects in the same way of vinblastine but at not cytotoxic concentrations. Therefore, we evaluated the in vitro and in vivo effects on angiogenesis induced by some pyrroloazaflavones (7-phenyl-3H-pyrrolo[3,2-f]quinolinones and 2-phenyl-7H-pyrrolo[2,3-h]quinolinones), using vinblastine as reference compound. Our results on HUVECs indicate that some 2-PyQs and 7-PyQs are able, at not cytotoxic concentrations and like vinblastine, to i) exert both in vitro and in vivo anti-angiogenic activity, and ii) counteract the pro-angiogenic effects of fibroblast growth factor-2 (FGF-2), well-known cytokine involved in tumor growth.

Abstract (italiano)

Questo lavoro di dottorato si è focalizzato sullo screening dell’attività citotossica e antiangiogenica in vitro e in vivo di due serie di composti di nuova sintesi: derivati 4-aminochinazolinici, inibitori tirosin-chinasici per il recettore EGFR, e derivati fenil-pirrolochinolinonici, agenti antimitotici ad attività antitubulinica.
EGFR risulta sovra-espresso in numerose forme tumorali, nelle quali la sua attivazione risulta priva di controllo, comportando alterazione dei processi di proliferazione e differenziamento cellulari. Tra gli approcci terapeutici basati su composti in grado di inibire EGFR attraverso il binding ai suoi diversi domini, appare particolarmente interessante lo sviluppo di inibitori delle tirosin-chinasi, che agiscono legandosi alla porzione intracellulare del recettore. EGFR svolge un ruolo centrale anche nell’angiogenesi tumorale in quanto presente anche sulle cellule endoteliali localizzate all’interno della massa tumorale. Un’alterata espressione o attivazione del recettore di EGF è stata identificata in numerosi tumori solidi e si è visto che bloccando EGFR di cellule epiteliali neoplastiche si ottiene un effetto antiangiogenico dovuto soprattutto alla diminuzione di fattori proangiogenici nell’ambiente tumorale. Utilizzando cellule tumorali A431, sovraesprimenti EGFR, è stata valutata l’attività antitumorale di 18 composti, strutturalmente analoghi di PD153035 e Vandetanib, ed in cui erano stati introdotti un ciclo a 5, 6 o 7 atomi e alcuni sostituenti all’anilina a diversa lipofilia e ingombro sterico. I derivati che presentavano la ciclizzazione dei due ponti metossilici del PD153035, con formazione di un eterociclo a 6 atomi, si sono dimostrati più attivi nell’inibire la vitalità delle A431 anche attraverso l’induzione del processo apoptotico e in misura maggiore rispetto ai TKI di riferimento. I risultati ottenuti hanno inoltre suggerito che i sostituenti all’anello dell’anilina possono modulare l’attività antiproliferativa sia in senso positivo che negativo. In particolare, l’aumento del carattere lipofilo della struttura si traduce nell’induzione di un effetto citotossico paragonabile o maggiore di quello osservabile in presenza di PD153035. E’ stato già dimostrato che i TKI interagiscono con il recettore, non solo a livello del suo sito catalitico, ma si inseriscono anche in un’adiacente tasca lipofila. Quindi l’inserimento di gruppi non polari (come un gruppo metilico), o comunque caratterizzati da elevata lipofilia (gruppo trifluorometilico), aumentano l’affinità del composto nei confronti della proteina e possono potenziare l’attività citotossica. Un’ulteriore conferma della maggiore affinità indotta dai sostituenti non polari è data dai 3 derivati che presentano un gruppo fenilico sull’anilina, i quali hanno dimostrato un effetto antiproliferativo che si è manifestato anche in seguito a rimozione della sostanza dal mezzo di coltura. A conferma delle considerazioni sul rapporto struttura/attività, i composti che presentano l’introduzione dell’eterociclo a 6 atomi e il sostituente fenilico all’anilina hanno inoltre dimostrato una maggiore attività antiangiogenica, attraverso saggi condotti su cellule endoteliali HUVEC. Questi derivati, infatti, erano in grado di inibire le varie tappe in vitro del processo angiogenico, quali proliferazione e migrazione cellulare e formazione di strutture simil-capillari su Matrigel, anche in presenza di citochine proangiogeniche esogene, e l’angiogenesi in vivo, in misura maggiore rispetto ai composti di riferimento.

Gli agenti anti-mitotici sono una classe di composti utilizzati in terapia antitumorale per l’elevata attività antiproliferativa. Un esempio di sostanze attive in questo senso sono i flavoni, composti polifenolici presenti in natura in grado di inibire la polimerizzazione della tubulina, componente base dei microtubuli. Interferendo sulla dinamica di assemblaggio-disassemblaggio degli α,β-eterodimeri di tubulina, inducono la morte cellulare senza provocare danni al DNA. Tale meccanismo d’azione è anche alla base dell’attività antiangiogenica, manifestata da alcuni composti di questa classe. I derivati fenil-pirrolochinolinonici presentavano geometria [3,2-f] o geometria [2,3-h] e diversi sostituenti introdotti alla chinolina. La valutazione della loro attività antiangiogenica ha mostrato la capacità di alcuni composti, di entrambe le categorie, di inibire il processo di neovascolarizzazione sia in vitro che in vivo a concentrazioni non citotossiche, e di contrastare gli effetti stimolatori di FGF-2, importante citochina coinvolta nella progressione e angiogenesi tumorale.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Parnigotto, PP - Conconi, MT
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > BIOLOGIA E MEDICINA DELLA RIGENERAZIONE > INGEGNERIA DEI TESSUTI E DEI TRAPIANTI
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:15 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):antitumorali, antiangiogenici, angiogenesi, EGFR, aminochinazoline, fenil-pirrolochinolinoni, antitubulinici.
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/13 Biologia applicata
Area 05 - Scienze biologiche > BIO/15 Biologia farmaceutica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Farmaceutiche
Codice ID:2306
Depositato il:24 Set 2010 10:53
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