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Abstract (inglese)

Helicobacter pylori is a Gram-negative microaerophilic bacterium that is able to establish a life-long chronic infection in the stomach of more than half of the human population. The infection is most of the times asymptomatic but, in an important minority of cases, H. pylori causes gastroduodenal pathologies, including stomach and duodenal ulcers, adenocarcinomas and stomach lymphomas. H. pylori is characterized by high genetic variability, not only in gene sequence but also in gene content. One of the most striking differences in H. pylori strains is the presence or absence of a 40-kb DNA sequence named cag Pathogenicity Island, that encodes a Type IV Secretion System, causing the traslocation of CagA toxin into epithelial gastric cells. After entering the host cell, CagA induces cellular modifications, including alteration of cell structure and motility, alteration of cell proliferation and of tight junctions. Most of H. pylori strains secrete VacA, a toxin that provokes vacuolization in
epithelial cells. All H. pylori strains contain a vacA gene, but the gene sequence is highly variable, causing changes in VacA functional activity. Other properties affected by genetic variability are expression and binding ability of adhesins. All these features are involved in pathogenical variability of H. pylori, in addition to HP-NAP, a toxin able to activate immunological response (Chapter I). Although H. pylori can be successfully eradicated by antibiotics in many patients,increasing
antibiotic resistance in the bacterium remains a serious problem. New therapies are required to eradicate H. pylori infection and looking for new pharmaceutical targets could be useful for the development of new antibiotics in the future. Recently, new genes involved in H. pylori stomach colonization were identified by mutagenesis. Of the genes analyzed, 29% had a predicted stomach colonization effect. These included known H. pylori virulence genes, genes implicated in virulence in other pathogenic bacteria, and genes codifying for hypothetical proteins. The aim of this project was to determine the three-dimensional structure of H. pylori proteins important for stomach colonization and pathogenesis and to obtain information about their putative functions. In particular, we focalized our attention on the TenA homologue HP1287, on the putative adhesin HP1028, on HP0175, a toxin with PPIase activity, and on HP0421, a cholesterol-α-glucosyltransferase that promotes immune evasion.The research described in this thesis was mostly carried out at the Department of Biological Chemistry, University of Padua and Venetian Institute of Molecular Medicine (VIMM), Padua. The strategy adopted involved bioinformatic analyses, PCR amplification of the selected genes starting from purified H. pylori chromosomal DNA (strain CCUG 17874), cloning in an His-tag-containing vector and expression of the protein in E. coli cells. The soluble recombinant proteins were then purified using two chromatography steps and concentrated for crystallization trials. The proteins HP1028 and HP1287 were subsequently crystallized and, in the case of HP1287, the structure was determined by X-Ray diffraction. Techniques to make the protein samples more suitable for crystallization, as DLS (Dynamic light scattering), and to investigate the secondary structure, as CD (Circular dichroism), were also used. Mutagenesis techniques were included for functional studies and for crystallographic purposes. After a general introduction, the structural and functional analysis of HP287 from H. pylori is described in Chapter II. HP1287 is a homologue of TenA from B. subtilis, an enzyme involved in thiamin precursors salvage. The protein was cloned, expressed, purified and crystallized. The structure was solved by Molecular Replacement and refined at 2.7 Å. The structure reveals a very high similarity with TenA from B. subtilis, with the only difference of the substitution of one amino acid in the active site (a tyrosine substituted with a
phenylalanine in HP1287). Since HP1287 was not active on the same substrate of TenA from B. subtilis, a HP1287 F47Y mutant was created to investigate on the importance of Y47 in restoring the activity, but the HP1287 activity remained low. Moreover, the position of the H86 in the HP1287 active site seems to suggest an additional interaction with the substrate, not possible in TenA from B. subtilis. These findings suggested that the enzyme is specific for another slightly different substrate, that probably comes from the thiamin degradation in the stomach.
The third chapter describes the cloning, expression, purification and crystallization of HP1028, a putative adhesin important for stomach colonization. To identify a detergent able to inhibit aggregation, protein samples were incubated with several detergents and analyzed by DLS (Dynamic Light Scattering). Since no homologue structures are known, to get initial phases to solve the structure, a selenomethionine derivative was produced. To improve the anomalous signal of selenium, a double mutant was created, adding two methionines in the
amino acid sequence. Preliminary data of native and mutant HP1028 were collected at 2.4 Å. HP0175 is a Peptidyl Prolyl cis,trans-Isomerase that induces apoptosis of gastric epithelial
cells through TLR4 (described in chapter IV). After cloning, the protein was expressed and purified in very high yield and its secondary structure was analyzed by CD. To reduce the excessively high solubility of the protein, a lysines methylation approach was adopted. Some crystallization trials were performed. Finally, the last chapter (chapter V) describes HP0421, a cholesterol-α-glucosyltransferase that promotes immune evasion. H. pylori cells containing high levels of cholesterol are easily sequestered by macrophages. Intrinsic α-glucosylation of cholesterol abrogates phagocytosis of H. pylori and T cell activation. This part of the PhD project was carried out at the Max Planck Institute for Infection Biology in Berlin, under the supervision of Prof. Thomas F. Meyer. The recombinant protein, expressed in E. coli, did not bind strongly to the affinity IMAC-Ni2+ resin, probably because of the degradation of the C-terminal His-tag. To solve the purification problems, two approaches were adopted: the cloning of a new HP0421 construct with an N-terminal His-tag and the purification and the refolding of the HP0421 protein from the pellet, verified by activity tests. Moreover, DLS analysis of HP0421, purified in small yield, showed that the protein was aggregated. Aggregation inhibition tests with detergents were attempted.

Abstract (italiano)

Helicobacter pylori è un batterio microaerofilo Gram-negativo in grado di instaurare un’infezione cronica nello stomaco umano in più della metà della popolazione mondiale.
L’infezione è generalmente asintomatica ma, in alcuni casi, H. pylori causa patologie gastroduodenali, quali ulcere gastriche e duodenali, adenocarcinomi e linfomi gastrici. H. pylori è caratterizzato da elevata variabilità genetica, non solo all’interno delle sequenze geniche ma anche nel contenuto genico. Una delle differenze più importanti nei ceppi di H. pylori è la presenza o l’assenza di una sequenza di DNA di 40 kb chiamata Isola di Patogenicità cag, che codifica per un Sistema di Secrezione di tipo IV, che provoca la traslocazione della tossina CagA nelle cellule epiteliali gastriche. Dopo l’entrata nella cellula ospite, CagA induce modifiche cellulari come l’alterazione della struttura cellulare e della motilità, l’alterazione della proliferazione cellulare e delle tight junctions. La maggior parte dei ceppi di H. pylori secernono VacA, una tossina che provoca vacuolizzazione delle cellule epiteliali dello stomaco. Tutti i ceppi di H. pylori contengono il gene vacA, ma la sequenza genica è caratterizzata da un’elevata variabilità, causando modifiche nella funzionalità della tossina. Altre caratteristiche condizionate dalla variabilità genetica sono l’espressione e la forza di legame delle adesine. Tutte queste caratteristiche sono coinvolte nella diversità del grado di virulenza di H. pylori, assieme a HP-NAP, una tossina in grado di attivare la risposta immunitaria (Capitolo I).
Sebbene la terapia antibiotica sia in grado di eradicare H. pylori nella maggior parte dei pazienti, la resistenza ai chemioterapici da parte dei batteri rimane un problema sempre crescente. Per questo motivo, sono necessarie nuove terapie per l’eradicazione del batterio e, in questo contesto, è importante identificare nuovi bersagli farmaceutici per lo sviluppo di nuovi antibiotici specifici.
Recentemente uno studio di mutagenesi sistematica del genoma di H. pylori ha permesso d’identificare nuovi geni coinvolti nella colonizzazione dello stomaco. Dei geni analizzati, 29% hanno evidenziato un effetto nella colonizzazione gastrica. Tra questi sono stati identificati geni di virulenza già noti, geni importanti per la virulenza in altri patogeni e geni codificanti per proteine ignote.
Scopo di questo progetto di dottorato è determinare la struttura tridimensionale di proteine di H. pylori importanti per la colonizzazione dello stomaco e la patogenesi e ottenere informazioni sulla loro putativa funzione. In particolare, sono state studiate le proteine HP1287, omologo di TenA, la putativa adesina HP1028, HP0175, una tossina con attività PPIasica e HP0421, una colesterol-α-glucosiltrasferasi che inibisce la risposta immunitaria.
La maggior parte del progetto è stata effettuata presso il laboratorio di Biologia Strutturale del Prof. Zanotti al Dipartimento di Chimica Biologica dell’Università di Padova e presso l’Istituto Veneto di Medicina Molecolare (VIMM) di Padova.
La strategia di lavoro adottata comprendeva analisi bioinformatiche, amplificazione dei geni selezionati mediante PCR a partire dal DNA genomico di H. pylori (ceppo CCUG 17874), clonaggio in un vettore di espressione in fusione con un His-tag N-terminale e l’espressione della proteina in cellule batteriche di Escherichia coli. Le proteine ricombinanti solubili sono state poi purificate usando due passaggi cromatografici e concentrate per le prove di cristallizzazione. Le proteine HP1028 e HP1287 sono state successivamente cristallizzate e, nel caso di HP1287, è stata risolta la struttura mediante diffrattometria ai raggi X. Inoltre, sono state utilizzate anche tecniche per verificare la qualità del campione per la cristallizzazione, come il DLS (Dynamic Light Scattering) e per analizzare la struttura secondaria, come il Dicroismo circolare (CD). Tecniche di mutagenesi sono state impiegate per studi funzionali e per fini cristallografici.
Dopo un’introduzione generale, nel capitolo II è descritta l’analisi strutturale e funzionale di HP1287 di H. pylori. HP1287 è un omologo di TenA di B. subtilis, un enzima coinvolto nel
recupero di precursori della tiamina. La proteina è stata clonata, espressa, purificata e cristallizzata. La struttura è stata risolta mediante Sostituzione Molecolare ad una risoluzione di 2.7 Å. La struttura evidenzia un elevato grado di similarità con TenA di B. subtilus, con la sola differenza della sostituzione di un amminoacido nel sito attivo (una tirosina sostituita con una fenilalanina in HP1287). Poiché HP1287 sembrava non essere attiva nello stesso substrato di TenA di B. subtilis, per verificare l’importanza della tirosina in posizione 47 nel ripristino dell’attività catalitica, è stato creato un mutante F47Y, che però non ha evidenziato una maggior capacità di catalisi rispetto alla HP1287 nativa. Inoltre, la collocazione dell’istidina 86 nel sito attivo di HP1287, sembrerebbe suggerire un’interazione dell’amminoacido con il substrato non possibile nel caso di TenA di B. subtilis. Tutte queste informazioni suggeriscono come questa proteina potrebbe metabolizzare un composto leggermente diverso da quello di TenA di B. subtilis, che deriva dalla degradazione della tiamina nello stomaco.
Il terzo capitolo descrive il clonaggio, l’espressione, la purificazione e la cristallizzazione di HP1028, una putativa adesina importante per la colonizzazione dello stomaco. Per identificare un detergente in grado d’inibire l’aggregazione, campioni proteici sono stati incubati con numerosi detergenti e analizzati mediante DLS (Dynamic Light Scattering). Non essendo nota alcuna struttura di alcuna proteina omologa, per ottenere fasi approssimate iniziali per la risoluzione della struttura, la proteina HP1028 è stata espressa sostituendo le metionine con selenometionine e purificata. Per amplificare il segnale anomalo del selenio, è stato creato un doppio mutante contenente due ulteriori metionine nella sequenza amminoacidica. Dati preliminari della proteina HP1028 nativa e mutante sono stati raccolti ad una risoluzione massima di 2.4 Å.
HP0175 è una Peptidil-Prolil-cis,trans-Isomerasi che induce l’apoptosi di cellule gastriche attraverso il TLR4 (descritta nel capitolo IV). Dopo il clonaggio del gene nel plasmide d’espressione, la proteina è stata espressa e purificata in elevata quantità e la struttura secondaria è stata analizzata mediante CD. Per ridurre l’eccessivamente alta solubilità della
proteina, è stata adottata una metodica di metilazione delle lisine e sono state effettuate numerose prove di cristallizzazione della proteina derivatizzata.
Infine, nell’ultimo capitolo (Capitolo V) è descritta la proteina HP0421, una colesterol-α- glucosiltransferasi che promuove l’immuno-evasione. Cellule batteriche di H. pylori contenenti alti livelli di colesterolo sono facilmente fagocitate dai macrofagi. La glicosilazione del colesterolo inibisce l’uptake di H. pylori da parte dei macrofagi e l’attivazione dei linfociti T. Questa parte del progetto di dottorato è stata svolta presso l’istituto Max Planck di Berlino, sotto la supervisione del Prof. Thomas F. Meyer. La proteina ricombinante, espressa in E. coli, sembrava non essere in grado di legare la resina d’affinità IMAC-Ni2+, probabilmente a causa della degradazione dell’His-tag C-terminale. Per risolvere questi problemi durante la fase di purificazione, sono stati adottati due approcci: il clonaggio d’un nuovo costrutto di HP0421 con un His-tag N-terminale e la purificazione e il refolding della proteina HP0421 dal pellet batterico, validato da test di attività. Inoltre, studi di DLS su HP0421, purificata in modeste quantità, hanno evidenziato lo stato di aggregazione della proteina. Per inibire l’interazione aspecifica tra le molecole proteiche, sono state effettuate
prove di disaggregazione con detergenti, verificate mediante analisi DLS.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Battistutta, Roberto
Correlatore:Zanotti, Giuseppe
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > SCIENZE MOLECOLARI > SCIENZE CHIMICHE
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:24 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):Structure, Crystallography, Helicobacter pylori, thiamin, HP1287, HP1028, HP0175, HP0421.
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/10 Biochimica
Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chimiche
Codice ID:2424
Depositato il:08 Nov 2010 10:48
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