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tuccino, annunziata (2010) Establishiment of Canine RNA polymerase I-Promoter driven Reverse Genetics for Influenza A virus. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Reverse Genetics

Killed and live influenza virus vaccines are effective in preventing and curbing the spread of disease but the antigenic variation of influenza A virus hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) glycoproteins requires frequent changes in vaccine formulation. New technologies such as Reverse Genetics (RG) could be used to shorten the lengthy process of preparing vaccine seed viruses. By using RG can be generate a backbone that contain six internal genes from high-yield viruses and HA and NA genes from the circulating strains.
In this work we have established a human RNA polymerase I (polI)-driven influenza virus RG system in the human embryonic kidney 293T cell line. But RNA polI polymerases have an obstacle: they are generally active only in cells of species closely related to the species of origin of the polymerases and, 293T are not approved for human vaccine production. So we move to replace the human with the canine polI promoter in order to adapt the RG system to Madin-Darby canine kidney cell line that is approved from FDA for human vaccine production and support the efficient growth of influenza virus. We have evidence that also the new system is able to give infection virus particles.
Our findings demonstrate that the eight-plasmid system allows the rapid and reproducible generation of reassortant influenza A viruses for use in the manufacture of vaccines.
By taking advantage of these new technologies, we could quickly develop live vaccines that would be safe, cross-protective against variant strains, and require less virus per dose than conventional vaccines.

Fluinnate

Influenza A viruses are important worldwide pathogens for humans and different animal species. These viruses have been isolated from avian and mammalian hosts, although the primary reservoirs are in evolutionary stasis. The aquatic bird viruses do not replicate well in humans, and these viruses need to reassort or adapt in an intermediate host before they emerge in human populations. A non-optimal receptor-binding specificity of avian influenza viruses is believed to hamper their replication in humans. During the course of a single-cycle infection, human viruses preferentially infected non-ciliated cells, whereas avian viruses as well as the egg-adapted human virus variant with an avian virus-like receptor specificity mainly infected ciliated cells. This pattern correlated with the predominant localization of receptors for human viruses (2–6-linked sialic acids) on non-ciliated cells and of receptors for avian viruses (2–3-linked sialic acids) on ciliated cells. These findings corroborate that although avian influenza viruses can infect human airway epithelium, their replication may be limited by a non-optimal cellular tropism.
By RG we generate recombinant viruses that differs solely in their HA receptor specificity: R1 harbored the original HA of the pandemic human virus A/Hong Kong/1/68 (H3N2), and R2, the L226Q/S228G HA mutant with avian-virus-like receptor specificity. We use these viruses to investigate if receptor specificity and sialidase activity of influenza virus can affect innate immune responses to the virus and thus determine its pathogenicity. We test genes and cellular response in differentiated cultures of human airway epithelium and in isolated human immuno-competent cells infected by R1 and/or R2, finding that the first innate immune responses to influenza virus infection in airway epithelium can be significantly determined by the binding properties of the virus hemagglutinin molecules.

Abstract (italiano)

Reverse Genetics

I vaccini per l’influenza, vivi e uccisi, sono efficaci nel prevenire e tenere sotto controllo il diffondersi della malattia, ma le variazioni antigeniche che caraterizzano le glicoproteine emmaglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) del virus dell’influenza A, richiedono frequenti cambi nella loro formulazione. Le nuove tecnologie come la Reverse Genetics (RG), attraverso la quale è possible recuperare il virus infettivo da cellule trasfettate con DNA plasmidico che codifica gli 8 segmenti del genoma virale, potrebbero essere utili per accorciare i tempi di ottenimento del “seme virale” per la preparazione dei vaccini. Infatti, la RG può permettere di ottenere rapidamente riassortanti con ottime caratteristiche di crescita in uova o cellule MDCK (cellule renali di cane) attraverso la combinazione dei sei geni interni da virus ad alta produttività e HA e NA dai ceppi circolanti.
Lo scopo della mia tesi è stato quello di esplorare il possibile uso di questa nuova tecnica per generare e produrre vaccini influenzali.
Per fare questo, abbiamo messo a punto un sistema di Reverse Genetics in cui l’RNA polimerasi (polI) canina, permette al virus di svilupparsi in MDCK, una linea cellulare approvata dall’FDA per la produzione di vaccini influenzali e che supporta un’efficiente crescita del virus stesso. Le nostre scoperte dimostrano che il sistema di RG a 8 plasmidi consente una rapida e riproducibile generazione di riassortanti dell’influenza A da poter utlizzare nella preparazione dei vaccini. Grazie all’aiuto di questa nuova tecnologia, potremmo sviluppare rapidamente vaccini sicuri, cross protettivi tra i vari ceppi virali e che richiedono una quantità minore di virus rispetto a quelli tradizionali.

Fluinnate

Il virus dell’influenza A è un notevole patogeno sia per gli uomini che per diverse specie animali. Questi virus sono stati isolati sia da uccelli che da mammiferi sebbene nei primi siano in una fase di stasi dal punta di vista evolutivo. I virus che infettano gli uccelli acquatici non hanno potere contaminate sull’uomo in quanto hanno necessità di riassortarsi e adattarsi ad un ospite intermedio prima di emergere nel genere umano. Si pensa che l’impedimento della replicazione negli uomini da parte del virus aviario sia dovuto ad una non ottimale specificità di recettore di legame. Durante il singolo ciclo infettivo, il virus umano preferenzialmente infetta le cellule non ciliate, mentre quello aviario, così come la variante della forma umana adattata a crescere nelle uova che ritorna ad avere una specificità di recettore aviaria, preferenzialmente infetta le cellule ciliate. Questo presupposto è in accordo con la predominante localizzazione dei recettori per la forma umana (acidi sialici legati con un legame di tipo α2-6) sulle cellule non ciliate e dei recettori per la forma aviaria (acidi sialici legati con un legame di tipo α2-3) su quelle ciliate. Queste scoperte rafforzano l’idea che sebbene il virus dell’influenza aviaria può infettare l’epitelio del tratto respiratorio umano, la sua capacità di replicazione rimane limitata ad un tropismo cellulare non ottimale.
Attraverso la RG abbiamo generato diversi virus ricombinanti che defferiscono unicamente nella loro specificità di recettore per l’HA e li abbiamo utilizzati per esaminare se quest’ultima unita all’attività sialidasica del virus può influenzare la risposta immunitaria determinandone la patogenicità. Abbiamo testato le risposte immunitarie e cellulari su colture differenziate di epitelio respiratorio umano e su cellule umane immunocompetenti isolate, scoprendo che l’iniziale risposta immunitaria innata scaturita dall’infezione da parte del virus nell’epitelio respiratorio, può essere determinata in maniera significativa dalle proprietà di legame della molecola di emmaglutinina virale.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Montecucco, Cesare
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > BIOSCIENZE > BIOLOGIA CELLULARE
Data di deposito della tesi:28 Marzo 2012
Anno di Pubblicazione:26 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):reverse genetics
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali
Codice ID:2507
Depositato il:20 Set 2010 13:40
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