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Gutla, P.V.K. (2010) Ion transport mediated by the Slow Vacuolar channel in plant cell vacuoles: biophysical properties and modulation by endogenous molecules. [Tesi di dottorato]

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Documento PDF (PhD thesis of P.V.K Gutla) - Versione sottomessa
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Abstract (inglese)

The Slow Vacuolar channel, ubiquitous in plant cells, has been investigated for almost 25 years; nevertheless its role remains still elusive. In search of compounds that are able to change its properties providing useful information for its physiological role, we investigated the modulation of the SV channel by the flavonoid Naringenin (Nar) using the patch-clamp technique. Experiments were conducted on vacuoles obtained from carrot roots and from mesophyll cells of Arabidopsis thaliana leaves. Firstly, the presence of non-glycosylated Nar in the cytoplasm was verified by localization studies, then patch-clamp experiments in the excised patch configuration revealed that Nar inhibits the SV channel in a reversible dose-dependent manner, shifting the threshold of activation of the SV currents towards more positive membrane potentials. Cytosolic Nar did not change the amplitude of the single channel conductance but decreased the mean open time of the channel. We also demonstrated that Nar inhibits equally well the permeation of both K+ and Ca2+ through the SV channel. Flavonoids sharing structural similarities with Nar, induced a comparable inhibition of the SV currents. Inside-out patch experiments performed in vacuoles from Arabidopsis thaliana mesophyll cells and carrot roots revealed that Nar inhibits the SV channel also when added at the luminal side. Naringin, the glycosylated form of Nar, was unable to change the channel activity when added at both sides of the membrane. Finally, in accordance with a higher hydrophobicity of the flavonoids at acidic pHs, Nar inhibition increases decreasing the pH of the cytosolic bath solution. All these evidences point to the possibility that flavonoid interaction with the SV channel is mediated by the membrane phospholipids. To further investigate this possibility we studied the interaction of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) with the SV channel in vacuoles from carrot roots. Similarly to Nar, both Arachidonic Acid (AA) and Docosahexaenoic Acid (DHA) added at the cytosolic side induced a dose-dependent reversible decrease in the SV channel activity. Also AA shifted the SV activation to more positive voltages without changing the amplitude of the single channel conductance. These studies suggest that important endogenous molecules, such as flavonoids and PUFAS, are able to change the properties of the slow vacuolar channel, possibly through a lipid mediated interaction. This biophysical characterization opens new perspectives to investigate the properties of this enigmatic channel in different plant species and tissues.

Abstract (italiano)

Il canale Slow Vacuolar (SV), un canale ubiquitario in sistemi vegetali, è studiato da circa 25 anni ma il suo ruolo fisiologico rimane tuttora elusivo. Alla ricerca di molecole che potrebbero essere in grado di modularne le proprietà fornendo informazioni utili alla comprensione del suo ruolo fisiologico, mediante metodologia di “patch-clamp abbiamo studiato le modificazioni indotte da Naringenina (Nar) su detto canale in vacuoli estratti dalla radice di carota o dal mesofillo della foglia di Arabidopsis thaliana. La presenza nel citoplasma di Naringenina, un flavonoide non-glicosilato, è stata preventivamente verificata mediante studi di localizzazione. Successivamente esperimenti di patch-clamp nella configurazione “excised-out” hanno dimostrato che Nar inibisce il canale SV in modo reversibile e dipendente dalla concentrazione di flavonoide mentre la soglia di attivazione del canale viene spostata verso potenziali più positivi. L’aggiunta di Nar alla soluzione citosolica non cambia l’ampiezza di singolo canale ma diminuisce aumenta il tempo di vita media del canale in stato aperto. Abbiamo anche dimostrato che Naringenina inibisce allo stesso modo sia il trasporto di K+ che di Ca2+ attraverso il canale SV. Inoltre i flavonoidi con struttura simile a quella di Naringenina inducono inibizioni confrontabili delle correnti SV. Esperimenti effettuati in configurazione “inside out” su vacuoli ottenuti da Arabidopsis e da carota hanno dimostrato che Nar inibisce il canale SV anche quando essa viene aggiunta dal lato vacuolare. Invece Naringin, la forma glicosilata della Naringenina, non è in grado di cambiare l’attività del canale sia che essa venga aggiunta al lato citosolico che al lato vacuolare. Infine, in accordo con l’aumento di idrofobicità dei flavonoidi utilizzati a pH acidi, l’inibizione delle correnti SV mediate da Nar aumenta diminuendo il pH della soluzione citosolica. Tutte queste evidenze suggeriscono che l’interazione tra flavonoidi e canale SV possa essere mediata dai lipidi di membrana. Per sviluppare ulteriormente questa ipotesi di lavoro abbiamo studiato l’interazione di alcuni acidi grassi polinsaturi (PUFAs) con il canale SV del vacuolo di carota. In maniera del tutto simile a quanto accade all’aggiunta di Nar, sia l’acido Arachidonico (AA) che l’acido Docoesaenoico (DHA), aggiunti alla soluzione citosolica, inducono una diminuzione reversibile e dose-dipendente dell’attività del canale. Come la Naringenina, anche AA sposta il potenziale di attivazione delle correnti SV verso valori di potenziali più positivi senza cambiare l’ampiezza di singolo canale. Questi studii suggerisconoo che alcune importanti molecole endogenee, quali i flavonoidi ed i PUFA, sono in grado di modifcare le proprietà del canale Slow Vacuolar, probabilmente attraverso un’interazione mediata dai lipidi di membrana. Questa caratterizzazione biofisica apre nuove prospettive per lo studio delle proprietà di questo enigmatico canale in specie vegetali ed in tessuti diversi.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Lo Schiavo, Fiorella - Gambale, Franco
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > BIOCHIMICA E BIOTECNOLOGIE > BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:27 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):vacuole, SV channel, TPC1, naringenin
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/04 Fisiologia vegetale
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:2567
Depositato il:20 Set 2010 10:37
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