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Cecchin, Denis (2010) Study and characterization of drug delivery system in regenerative medicine. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Abstract

Drug delivery system (DDS) technology is particularly promising to improve the in vivo efficiency of active molecules. Moreover, it is possible to stabilize and prolong the half life at biologically active molecules, thus prolonging the in vitro activity. DDS's can be used either for the delivery of anticancer drug but also for the controlled release of growth factors essential for the tissue engineering. In this work DDS’s have been investigate to develop new targeted anticancer drug or to control the release of growth factor for tissue engineering. In the first case polymer conjugates were chosen while in the second microspheres were used.

PEG conjugates

Anti-cancer drugs are very active molecules but they present limits that often prevent their success in chemotherapy. Common problems are a low half-life due to rapid kidney clearance, rapid inactivation by metabolic enzymes and low selectivity towards cancer cells and often a low solubility in water, these causing severe side effects.
To overcome this problems, polymeric conjugates were prepared by linking an anti-cancer drug to a polymer carrier. Polymeric conjugation improves the drug pharmacokinetic profiles by reducing drug clearance. Furthermore, a tumor targeting can be reached by two mechanisms: the first a passive accumulation into tumour tissue, known as the EPR (Enhanced Permeability and Retention) effect and the second an active targeting when a targeting molecule also is coupled to the conjugate. In this work an heterobifunctional poly-(ethylene glycol) was coupled to both epirubicin (EPI), an anti-cancer drug, and to folic acid (FOL) as targeting residue. The biological activity of the derivate FOL-PEG-EPI was studied in two different culture systems; the classic bi-dimensional (2D) system and the tri-dimensional (3D) system using Puramatrix hydrogel. The last should recreate an environment similar to the in vivo situation. The cytotoxicity activity studies were carried out on the following cell lines; HT-29, expressing a normal level of folic acid membrane receptor (FR), MCF-7, medium FR expression and KB-31cells over-expressing FR. The FOL-PEG-EPI cytotoxicity study, showed higher toxicity in KB-31 cells than MCF-7 and HT-29 in both 2D and 3D cell culture systems. Moreover, the use of the 3D culture system, displayed clearly that FOL-PEG-EPI had selective activity on cells over-expressing the folic acid receptor (KB-

31) compared to HT-29cells where to obtain the IC50 was used a conjugate concentration 3 fold higher than the maximum one permitted in clinic. The uptake of conjugates and epirubicin were studied by flow cytometry, and confocal microscopy. In the first case the cytometry showed the fluorescence signal inside the cells for both FOL-PEG-EPI and epirubicine alone. Also, the confocal analysis have confirmed the internalization, displayed the epirubicin in the nuclei and the conjugate in perinuclear side.

Microspheres

Tissue engineering is based on various disciplines such as medicine, biology, engineering and chemistry fused to the common aim to obtain or replace organs, or parts of organs in the human body. In general, a construct of tissue engineering is formed by the cellular component and a basic structure with function of support. The cells need to be stimulate by proper growth factor to generate a functional tissue. When the solution of growth factors is injected into the site for regeneration, the biological effect is not always optimal, because the biologically active substances are spread away from the site of action very quickly, or because they cannot get to the targeting site. It is therefore essential to develop a technology that stabilizes the administration and the answer can be a DDS.
Therefore, the second part of this study was focused on tissue engineering of bone tissue. The research involved the use a the drug delivery system for the controlled release of TAT-OP1 protein, which stimulates osteogenic differentiation. Osteogenic protein-1 (OP-1 or BMP-7) is a member of Bone Morfogenic Proteins’s family (BMPs). BMPs are a group of multi-functional growth factors belonging to the transforming growth factor β (TGF-β) superfamily. They are implicated in a variety of functions such as the formation of cartilage and bone, and the development of non-osteogenic tissues. BMPs are secreted as a precursor approximately four times longer than the mature form and share a C-terminal distinctive pattern (..C…CXGXC…CC…CXCX..) containing seven cysteines which are the active region of the proteins. In this study we used a recombinant fusion protein called TAT-OP1 which includes a TAT sequence, an Arg rich peptide, derived from a HIV protein, which allows the internalization. The construct TAT-OP1 has 162 amino acids starting with an N-terminal 6His-tag followed by the TAT sequence, a peptidase specific cleavage site (spanning 6 AA) and the C-terminal OP-1 domain (126 AA) containing the cysteines motif. When this type of

bioactive molecules is injected directly on the action site, it undergo a rapid inactivation and dilution effect, therefore this is the limit for in vivo use. To avoid this problem, the protein was encapsulated in polylactidecoglycolide (PLGA) microspheres. The bioactive molecules released from microspheres can be easily modulated by setting the formulation parameters and production technique. The spray drying technique was used to obtain the TAT-OP1 microspheres. The microspheres release of the TAT-OP1 over a period of 7 days was 98% and the encapsulation efficiency was 35%. The size measurement by SEM was 0.2-2 μm. The biological activity study on TAT-OP1 microspheres was conducted using pre-osteoblast MC3T3-E1 cell line at two different concentrations, 200nM and 27 nM. After the 7 and 14 days of treatment the cultures showed matrix mineralization and the assay testing for the alkaline phosphatase was positive. Also the presence of characteristic osteogenic markers, such as osteopontin and osteocalcin, was verified by immunofluorescence. These positive results led us to evaluate the biological activity of TAT-OP1 microspheres in a tri-dimensional culture system on cells isolated from umbilical cord blood (UCBMSC). The 3D model was made by using synthetic Puramatrix TM Hydrogel which is able to mimic the natural microenvironment.
Following encapsulation of the TAT-OP1 microspheres or the free TAT-OP1 into Puramatrix Hydrogel TM, the cellular response to TAT-OP1 stimulation was evaluated using transmission electron microscopy (TEM) analysis to detect the production of bone-matrix. After 27 days of stimulation with TAT-OP1 loaded microspheres(200 nM), partially aggregated microfibrils were observed around the cells. Calcification deposit and hydroxyapatite crystals were detected only in the cultures treated with TAT-OP1 PLGA microspheres (200nM) controlled release system. Therefore the controlled release of TAT-OP1 from PLGA microspheres was verified to increase the stimulation effectiveness. Future investigations will be directed to further confirm the suitability of this approach to improve the in vitro osteogenic differentiation and the biological activity of TAT-OP1 for an eventual clinical application in the field of bone tissue engineering.

Abstract (italiano)

Riassunto

I sistemi di drug delivery (DDSs) rappresentano una tecnologia particolarmente promettente per migliorare l'efficacia in vivo e in vitro di molecole biologicamente attive con l’obiettivo di circoscriverne l’effetto su una determinata tipologia di cellule, migliorarne l’efficacia, prolungarne il periodo di emivita e ridurre la tossicità di una terapia.
In questo lavoro sono stati studiati due modelli di Drug Delivery: il primo riguarda lo sviluppo di nuovi farmaci antitumorali selettivi mediante un coniugato polimerico, mentre il secondo modello, che trova applicazione nell’ambito dell’ingegneria tissutale, riguarda il rilascio controllato di fattori di crescita mediante microsfere.

PEG coniugato

I problemi più comuni riguardanti i farmaci anti-tumorali possono essere dovuti ad un tempo di emivita basso a causa di clearance renale rapida, all'inattivazione rapida da parte di enzimi, alla scarsa selettività cellulare e spesso ad una scarsa solubilità in ambiente fisiologico, oltre a gravi effetti collaterali.
Per cercare di ovviare, almeno in parte, a questi problemi, è stato preparato un coniugato polimerico direzionato al quale è stato legato un farmaco anti-cancro. Il coniugato migliora il profilo farmacocinetico del farmaco riducendo la clearance. Il “selective tumor targeting” può essere attivo o passivo. Il primo riguarda ligandi di recettori associati al tumore, che raggiungono il bersaglio sfruttando l’affinità ligando-recettore. Il secondo sistema può essere ottenuto sfruttando il
cosiddetto effetto EPR (enhanced permeability and retention effect) grazie al quale molecole ad alto
peso molecolare raggiungono e si accumulano nell’ambiente peritumorale.
In questo lavoro è stato utilizzato un poli-(etilenglicole) eterobifunzionale legato ad epirubicina (EPI), un farmaco anti-cancro, e ad acido folico (FOL), come residuo di targeting. L'attività biologica del derivato FOL-PEG-EPI è stata studiata in due diversi sistemi di coltura, il classico sistema bi-dimensionale ed il sistema tri-dimensionale utilizzando Puramatrix hydrogelTM. Quest’ultimo dovrebbe ricreare un ambiente simile a quello in vivo. Gli studi di attività citotossica sono stati effettuati sulle seguenti linee cellulari: HT-29, MCF-

7 e KB-31 che presentano una diversa espressione del recettore di membrana per l’acido folico (rispettivamente normale espressione, medio-alta, alta). Lo studio di citotossicità su FOL-PEG-EPI ha mostrato maggiore tossicità su cellule KB-31, con sovra-espressione del recettore per l’acido folico, rispetto alle cellule MCF-7 e HT-29, sia in colture 2D che 3D. Inoltre, l’utilizzo del sistema di coltura tri-dimensionale ha dimostrato che FOL-PEG-EPI possiede attività selettiva sulle cellule KB-31, rispetto alle cellule HT-29 dove per ottenere l’IC50 è stata utilizzata una concentrazione di coniugato 3 volte più alta della massima utilizzabile in clinica. L’up-take cellulare dei coniugati ed epirubicina sono stati studiati mediante citofluorimetria e microscopia confocale. Nel primo caso, la citofluorimetria ha mostrato la presenza del segnale di fluorescenza all'interno delle cellule sia per FOL-PEG-EPI che per epirubicina. L'analisi di microscopia confocale ha confermato l’internalizzazione, localizzando in zona nucleare il farmaco libero ed in zona perinucleare il coniugato.

Microsfere

L’ingegneria dei tessuti è un campo interdisciplinare che applica i principi dell’ingegneria e delle scienze della vita allo sviluppo di sostituti biologici per ristabilire, mantenere o migliorare la funzione di tessuti e organi danneggiati. In questa ricerca si fondono discipline di biologia cellulare, ingegneria, scienza dei materiali e chirurgia allo scopo di costruire, mediante la combinazione di cellule, materiali (“scaffold”) e fattori di crescita, nuovi tessuti funzionali.
I fattori di crescita possono essere impiegati per riprodurre le condizioni fisiologiche che consentono alle cellule di crescere, moltiplicarsi e differenziarsi nei diversi tipi di tessuti, ma la loro somministrazione rimane ancora una sfida tecnologica a causa della loro breve emivita nonché della loro difficoltà nel raggiungere il sito di targeting.
La seconda parte di questo studio ha riguardato lo sviluppo di un sistema di Drug Delivery applicato all’ingegneria tissutale del tessuto osseo. La ricerca ha coinvolto l'utilizzo di un sistema di veicolazione di farmaci per il rilascio controllato della proteina TAT-OP1, che stimola la differenziazione osteogenica. Osteogenic protein-1 (OP-1 o BMP-7) è un membro della famiglia delle proteine morfogeniche dell’osso (bone morphogenic proteins, BMPs). Le BMP vengono riconosciute come fattori di crescita osteoinduttivi, ovvero promotori della formazione di nuovo tessuto osseo e appartengono alla superfamiglia del TGF-β. Le BMP

sono secreti come precursori circa quattro volte più lunghi rispetto alla forma matura e possiedono una porzione C-terminale distintiva (pattern .. C ... CXGXC ... CC ... CXCX ..) contenente sette cisteine che costituiscono la regione attiva di queste proteine.
In questo studio è stata utilizzata una proteina ricombinante di fusione chiamata TAT-OP1 che comprende una sequenza TAT, un peptide ricco di arginina derivante dall’HIV e che permette l’internalizzazione. Il costrutto TAT-OP1, di 162 aminoacidi, comprende: una porzione N-terminale 6 His-tag seguito dalla sequenza TAT, un sito di cleavage peptidasi-specifico (spanning 6 AA) e il C-terminale con il dominio OP-1 (126 AA) contenente il motivo di cisteine. Quando questo tipo di molecola bioattiva viene iniettato direttamente nel sito di azione, viene sottoposta ad inattivazione e rapida diluizione; questo ne limita l'uso in vivo.
Per ovviare al problema sono state impiegate microsfere di poli-lattidecoglicolide (PLGA) per permettere un rilascio controllato di TAT-OP1 con l'obiettivo di mantenere un livello adeguato della proteina per tempi prolungati, migliorandone l’efficienza.
Il rilascio delle molecole bioattive può essere facilmente modulato settando i parametri nella formulazione e nella tecnica di produzione. La tecnica dello spray drying è stata utilizzata per ottenere le microsfere con TAT-OP1. Il rilascio dalle microsfere con TAT-OP1 è stato studiato in un periodo di 7 giorni e l'efficienza di incapsulamento era risultata del 35%. Le dimensioni al microscopio a scansione elettronica (SEM) risultavano comprese tra 0,2-2 µm. Lo studio dell’attività biologica su microsfere con TAT- OP1, è stato condotto utilizzando pre-osteoblasti MC3T3-E1 a due diverse concentrazioni, 200 e 27 nM.
Dopo 7 e 14 giorni di trattamento, le cellule mostravano presenza di mineralizzazione della matrice, test per la fosfatasi alcalina positivo e presenza di caratteristici marcatori osteogenici, quali osteopontina e osteocalcina. Questi risultati positivi ci hanno portato a valutare l'attività biologica della TAT- OP1 in microsfere in un sistema tri-dimensionale utilizzando cellule staminali mesenchimali isolate dal sangue del cordone ombelicale (UCBMSC). Il modello 3D è stata ottenuto utilizzando la matrice sintetica Puramatrix hydrogelTM, che è in grado di simulare il microambiente fisiologico. A seguito dell’incapsulazione di TAT-OP1 libera o di microsfere con TAT-OP1 in Puramatrix hydrogelTM, la risposta cellulare alla stimolazione di TAT-OP1 è stata valutata grazie all'analisi di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per rilevare la produzione di matrice ossea. Dopo 27 giorni di stimolazione con TAT-OP1 (200 nM), si osservava la presenza di microfibrille parzialmente aggregate attorno alle cellule. Depositi di calcio e cristalli di idrossiapatite sono stati rilevati solo in culture trattate con

microsfere a rilascio controllato di TAT-OP1 (200nM). Pertanto, il rilascio controllato di TAT-OP1 da microsfere di PLGA sembra aumentare l’efficacia di stimolazione. Future indagini saranno dirette a confermare ulteriormente la capacità del presente approccio nel migliorare lo studio di differenziamento osteogenico in vitro e l'attività biologica della TAT-OP1 per un eventuale applicazione clinica nel campo dell’ingegneria tissutale dell’osso.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Schiavon , Oddone
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > BIOLOGIA E MEDICINA DELLA RIGENERAZIONE > INGEGNERIA DEI TESSUTI E DEI TRAPIANTI
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:28 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):drug delivery, regenerative medicine, tissue engineering
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/09 Farmaceutico tecnologico applicativo
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Farmaceutiche
Codice ID:2643
Depositato il:20 Set 2010 10:58
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