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Pacifico, Daniela (2010) LA RISPOSTA ALLO STRESS DA FREDDO
IN Beta vulgaris
STUDIO DELLA MODULAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA.
[Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

The experimental part of this dissertation was performed in the institute of Agricultural Research Council - Research Institute for Industrial Crops (C.R.A.-C.I.N., Bologna). This institute is involved since long time in many research projects dealing with the breeding of Sugar Beet, specifically oriented towards the creation of genotypes resistant to osmotic stresses, as drought and cold stress.
In this study, classical breeding techniques were integrated with new molecular techniques, in the frame of two specific projects "Agronanotech" and "Agronanotech II".
With the main aim to improve the genetic adaptation of Sugar Beet to the dry Mediterranean climate, we studied the response of different cultivated accessions of Beta vulgaris (with both spring early sowing and autumnal late sowing) to cold stress, employing molecular, physiological and metabolic approaches and focusing specifically on metabolic pathways involved in the control of sucrose biosynthesis and distribution in the different tissues of the plant.
The employment of "dry/wet" strategies, where the integration of experimental analysis of "high-throughput" expression profiling leads to the achievement of an elevated amount of data with low costs and short time, supported by bioinformatic analyses, are the approaches of election used nowadays to investigate the molecular response of the species of interest.
The main purpose of this work was the investigation of the molecular mechanisms underlying the response to low temperatures both with a focused approach studying the modulation of the expression of specific target genes involved in determining trade-interesting characters as sucrose quality and yield and with a wider approach involving cDNA-AFLP analysis, in order to identify sequences whose expression was cold modulated. The results of this study lead to the identification of new cold responsive sequences and permitted to identify differences in the molecular and physiological responses between the two varieties (Bianca and Franca) selected to growth in different climatic areas.
The complete research activity can be summarized in the following steps:
1. A preliminary investigation on the two varieties Bianca and Franca was performed to verify their different tolerance to cold , identifying the ideal temperature to be used for the treatment and necessary for the stress to be perceived from the plants but not lethal, in order to allow the subsequent expression analyses.
2. An accurate selection of the reference genes, necessary for the normalization of the expression data, was carried out since the utilization of inappropriate reference genes results in incorrect interpretation of the expression data. The evaluation of 7 genes usually used as reference genes in other species, experimental conditions and plant organs showed the 18S and tubulin as the most stable genes in inter-tissue analysis, 5S and tubulin the best ones in low temperature-treated leaves and EF1alfa in low temperature-treated roots.
3. After the evaluation of the expression of two osmotic stress-regulated genes (DREB2A and CMO) in order to confirm that Beta vulgaris transcriptome was cold-stress responsive, other 10 genes involved in sugar metabolism were investigated. The modulation of the expression of these genes highlighted an increasing time-course response different in the two varieties examined and identified the cytosolic fructose 1,6 bisphosphatase as a putative central regulative point. It is actually conceivable that a better plant performance after exposition to low temperatures is dependent on its ability to convey the carbohydrate flux towards energy metabolism rather than towards sucrose accumulation and storage.
4. The localization of the transcripts of the studied genes was evaluated in leaf and/or roots, showing differential expression for the majority of them in one of the two organs considered.
5. A library of sequences modulated by low-temperature (0°C and -2°C) exposition of Beta vulgaris leaf and root in hydroponic culture was achieved by cDNA-AFLP analysis. 257 unigenes putatively involved in the response to low temperatures were identified and annotated from a functional point of view, through a bioinformatic research based on sequence similarity. This functional classification has allowed to estimate which biological and molecular processes were mainly involved in the response to low temperatures both in leaf and root tissues and showed that 47% of the analyzed sequences either did not find any similarity in the databanks interrogated or found a similarity with sequences coding for proteins with unknown function.
6. At the end, in order to investigate the putative correlation between the gene expression profiling and the changes of metobolites level, a HPLC-ELSD analysis and a 1H-HRMAS-NMR analysis were carried out.
The lack of extended sequence data on Beta vulgaris genome was overcome thanks to the integration of the expression analysis study with the in silico approach both in the initial and final phase of this research, allowing the complete development of the entire project.
In the initial phase, we identified different Tentative Consensus (TC) sequences of interest from the BvGI database (TIGR, Beta vulgaris Gene Index), which were then used to design 19 Real Time-PCR assays. While in the final phase, after cDNA-AFLP analysis, the functional annotation of the Transcript Differential Fragments (TDFs) identified, was possible thanks to the TC sequences available in online databanks.
In summary, the results collected showed that sugar beet plants grown at low temperatures underwent deep changes at the genetic expression level, involving mainly photosynthesis, carbohydrate and aminoacid metabolic processes. In some cases, such variations showed to be maintained in the time-course (as for fructose 1,6 bisphosphatase), but they are not reflected, at least apparently, by significative variation in the carbohydrate content. On the contrary, the aminoacid metabolism seems to be affected at both transcription and metabolic levels.
In the future, the analysis of osmotic stress modulated transcritpts will lead to a better understanding of the molecular response of sugar beet to abiotic stresses, also in comparison to the model species Arabidopsis. Moreover, it will identify putative genes correlated with stress resistance and adaptation, which might be useful as adaptive characters to be selected during breeding cycles, in Marker Assisted Selection (MAS), hopefully achieving in this way an evident increase in crop quality and yield.

Abstract (italiano)

Il lavoro di tesi è stato svolto presso il Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura - Centro di Ricerca per le Colture Industriali (C.R.A.-C.I.N., Bologna), impegnato da diversi anni in attività  di ricerca per il miglioramento genetico di barbabietola da zucchero per l'ottenimento di genotipi resistenti agli stress osmotici, quali lo stress idrico e il freddo. Nell' ambito dei progetti "Agronanotecnologie" e "Agronanotecnologie II" è stato possibile affiancare al miglioramento genetico classico, nuove tecnologie molecolari , le biotecnologie.
Ai fini del miglioramento genetico per l'aumento dell'adattabilità  all'ambiente mediterraneo, abbiamo studiato la risposta allo stress da freddo in varietà  commerciali (sia a semina precoce primaverile sia a semina autunnale) di Beta vulgaris, da un punto di vista molecolare, fisiologico e metabolico, con una particolare attenzione alle vie metaboliche che controllano la sintesi di saccarosio e la sua ripartizione fra gli organi della pianta.
L'approccio "dry/wet", ovvero l'integrazione di analisi sperimentali "high-throughput" del trascrittoma che consentono di ottenere una elevata quantità  di dati in tempi ridotti e di analisi bioinformatiche, rappresenta oggi la strategia di eccellenza per investigare la risposta molecolare della specie di interesse.
Lo scopo principale è stato quello di comprendere i meccanismi molecolari alla base della risposta alle basse temperature sia tramite un'analisi della modulazione dell'espressione genica di specifici geni target legati al carattere di maggior interesse in questa specie, ovvero la qualità  e la resa in saccarosio (CSY, Corrected Sucrose Yield), sia tramite analisi ad ampio spettro mediante la tecnica cDNA-AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), per identificare sequenze la cui espressione risulti modulata dalle basse temperature. Questo lavoro ha permesso di individuare nuove sequenze reponsive al freddo, e di studiare le differenze comportamentali, da un punto di vista molecolare e fisiologico, tra varietà  selezionate per areali climatici differenti.
L'attività  di ricerca svolta può essere riassunta nelle seguenti fasi:
1. Un'indagine preliminare sulla cv. Bianca e sulla cv. Franca ha permesso di verificare la diversa tolleranza al freddo delle due varietà , stabilendo, sulla base sperimentale, la temperatura di trattamento ideale, ovvero tale da garantire che lo stress venga percepito dalla pianta ma che non risulti letale, in modo tale da consentire le successive analisi di espressione.
2. Prima di determinare le variazioni dei livelli di trascritti tramite PCR quantitativa relativa, è stata condotta una selezione dei "geni di riferimento", denominati comunemente reference o housekeeping, necessaria per una normalizzazione accurata e precisa dei dati; ed è stato inoltre dimostrato che la normalizzazione su reference inappropriati risulta in una quantificazione errata. La valutazione di 7 geni comunemente impiegati come reference in altre specie, condizioni sperimentali e organi, ha permesso di identificare l'rRNA 18S e la tubulina come i migliori per analisi di espressione relativa condotte tra organi diversi messi a confronto (foglia, redice e cotiledone) e l'rRNA 5S e la tubulina per analisi su foglia di plantule trattate vs. controllo; allo stesso modo, è stato individuato l'elongation factor 1 α (EF1α) come migliore reference in radice.
3. Dopo aver valutato il livello dei trascritti realtivi a due geni noti per "rispondere" a livello di espressione a stress di tipo osmotico (DREB2A e colina mono-ossigenasi), le indagini successive hanno riguardato la modulazione dell'espressione di 10 geni di interesse correlati al metabolismo degli zuccheri. I riusltati evidenziano una risposta scalare nel tempo e differenziale nelle due cultivar prese in esame, e suggeriscono la fruttosio 1,6 bifosfatasi citosolica come nodo regolativo, almeno a livello di espressione, delle differenti riposte delle due cultivar. E' infatti possibile che ad una migliore performance dopo l'esposizione alle basse temperature sia legata la capacità  di convogliare il flusso dei carboidrati verso il metabolismo energetico piuttosto che verso l'accumulo in saccarosio.
4. L'analisi di espressione organo-specifica dei geni oggetto di studio in foglia e/o in radice è stata inoltre valutata, indicando che la maggior parte di essi ha un'espressione differenziale in uno dei due organi.
5. E' stata realizzata una libreria di sequenze di Beta vulgaris ottenuta, tramite cDNA-AFLP, dalle sequenze modulate dall'esposizione alle basse temperature di plantule di bietola in coltura idroponica (0°C e -2°C) in diversi organi (foglia e radice). 257 sequenze TDFs (Transcript- Derived Fragments) uniche (unigenes), putativamente coinvolte nella risposta alle basse temperature, sono state identificate e, attraverso una ricerca per similarità  di sequenza, caratterizzate da un punto di vista funzionale. La suddivisione in categorie funzionali ha consentito di stimare quali fossero i processi biologici e molecolari più coinvolti in tale risposta sia in foglia sia in radice. Il 47% delle sequenze risultano comunque sconosciute, in quanto non trova alcuna similarità  in banca dati, o trova similarità  con sequenze codificanti proteine a funzione non nota.
6. Al fine di verificare un'eventuale corrispondenza tra la modulazione dei geni analizzati e variazioni nel contenuto in metaboliti, un'analisi del profilo metabolico dei carboidrati è stato condotto tramite HPLC-ELSD (High Performance Liquid Chromatography- Evaporative Light Scattering Detector). Inoltre, tramite un'analisi ad ampio spettro 1H-HRMAS-NMR (High Resolution Magic Angle Spinning- Nuclear Magnetic Resonance) sono stati rilevati i cambiamenti relativi a più classi metaboliche contemporaneamente.
Nella fase iniziale e in quella conclusiva di questo lavoro, l'integrazione delle analisi di espressione con un lavoro in silico ha consentito di operare nonostante la mancanza di estesi dati di sequenza in Beta vulgaris, che avrebbe rappresentato un importante limite al proseguimento dell'attività  di ricerca. Inizialmente, una ricerca sul sito BvGI database (TIGR, Beta vulgaris Gene Index) ha fornito le sequenze Tentative Consensus (TC), ovvero trascritti virtuali ad alta fedeltà, relative a funzioni geniche di nostro interesse per le quali non è nota la sequenza genica completa. Sulla base di queste sequenze sono stati costruiti 19 saggi utilizzati per le indagine real-time PCR successive. A seguito dell'analisi cDNA-AFLP, è stato, inoltre, possibile attribuire a TDFs a funzione sconosciuta una collocazione sui TCs disponibili in banca dati per i quali, nella maggior parte dei casi, è stato possibile predire un'annotazione funzionale.
Complessivamente, i risultati ottenuti indicano che la barbabietola da zucchero sottoposta alle basse temperature subisce dei profondi cambiamenti a livello di espressione genica, che coinvolgono prevalentemente la fotosintesi, il metabolismo dei carboidrati e il metabolismo degli amminoacidi. In alcuni casi, tali variazioni possono risultare fissate nel tempo, come per la fruttosio 1,6 bifosfatasi, ma non si riflettono, almeno apparentemente, su significative variazioni nel contenuto di carboidrati. Al contrario, il metabolismo degli amminoacidi sembra invece coinvolto sia a livello di trascritti sia a livello di metaboliti.
Oltre che migliorare la conoscenza molecolare della risposta della barbabietola da zucchero a stress abiotici e rendere possibile un suo confronto con la specie modello Arabidopsis thaliana, l'analisi di trascritti genici modulati da stress osmotici consentirà  di individuare gli eventuali geni correlabili con una maggiore adattabilità  o resistenza, che a loro volta potrebbero risultare un valido strumento d'identificazione precoce, tramite selezione assistita da marcatori (MAS), durante il breeding per il miglioramento genetico varietale. Questo potrebbe consentire l'ottenimento di sensibili aumenti qualitativi e produttivi con ridotto impiego di tempi e costi.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Varotto, Serena
Correlatore:Mandolino, Giuseppe
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 21 > Scuole per il 21simo ciclo > SCIENZE DELLE PRODUZIONI VEGETALI > AGROBIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:28 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):Beta vulgaris, espressione genica, freddo
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/02 Agronomia e coltivazioni erbacee
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni Vegetali
Codice ID:2659
Depositato il:29 Set 2010 11:35
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