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Rondina, Maria (2010) Ingegnerizzazione di cellule T con un recettore chimerico anti-hPSMA per l'immunoterapia adottiva del carcinoma prostatico. [Tesi di dottorato]

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Documento PDF (Tesi di Dottorato)
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Abstract (inglese)

The genetic transfer of antigen receptors is a powerful approach to rapidly generate tumor-specific T lymphocytes to be employed in adoptive cell therapy (ACT) protocols. Differently from the physiological T-cell receptor, chimeric antigen receptors (CARs) encompass antigen recognition moieties, mainly derived from immunoglobulin variable regions, and activating domains derived from the TCR complex. This artificial structure combines the effector functions of T lymphocytes with the ability of antibodies to recognize surface antigens with high specificity and independently of antigen processing or MHC-restricted presentation.
During my Ph.D., I developed a second generation CAR containing both TCR and CD28 signalling moieties fused to a scFv targeting the human Prostate Specific Membrane Antigen (hPSMA), to engineer human PBMCs for the immunotherapy of prostate cancer. Instead of the most widely used oncoretroviral vectors we propose lentiviral vectors (LV) as an alternative gene transfer method, because of the ability to efficiently transduce even less activated or nondividing T cells. Moreover, the presence of a synthetic bidirectional promoter in the vector design for the coordinate expression of both CAR and Firefly Luciferase, enabled the in vivo monitoring of distribution and homing properties of adoptively transferred T cells with bioluminescence imaging (BLI).
The resulting population of CAR-engineered T cells (T-bodies) showed high level of CAR expression (more than 50% of cells), together with a memory phenotype and the ability to efficiently kill PSMA-expressing cells. The in vivo transfer in a subcutaneous model of prostate carcinoma demonstrated the T-bodies' anti-tumor efficacy upon local delivery, but highlighted the therapeutic failure of their systemic infusion. Data from BLI revealed the limited persistence of transferred T cells and their inability to efficiently reach the tumor.
Our findings support the feasibility of LV vectors as a valid and safe tool to engineer T cells with chimeric antigen receptors; the anti-tumor efficacy of lymphocytes endowed with second generation CARs constitutes a rationale for further studies and potential clinical application of the approach, but there is still the absolute need to improve persistence, survival and homing properties of infused T cells in order to get positive therapeutic results.

Abstract (italiano)

Nell'ambito dell'immunoterapia cellulare adottiva, l’ingegnerizzazione di linfociti T con recettori diretti contro antigeni tumorali rappresenta un'efficace strategia per generare in tempi rapidi un elevato numero di linfociti tumore-specifici. In alternativa al TCR fisiologico, la cellula T può essere ingegnerizzata con recettori chimerici per l'antigene (CAR) costituiti da un dominio di riconoscimento antigenico (derivato da anticorpi monoclonali) fuso a domini di trasduzione del segnale derivati dal complesso TCR: questo tipo di struttura combina la specificità del riconoscimento anticorpale (MHC-indipendente) con le potenzialità anti-tumorali dei linfociti T.
L’attività di ricerca svolta nel mio corso di Dottorato si è focalizzata sullo sviluppo di un protocollo per la generazione di linfociti T ingegnerizzati con un CAR di seconda generazione (scFv-CD28-CD3ζ) diretto contro l'antigene hPSMA (Prostate Specific Membrane Antigen) per il trattamento del carcinoma prostatico.
L'utilizzo di vettori lentivirali (LV) come alternativa ai più diffusi vettori oncoretrovirali, consente di trasdurre in modo efficace cellule T scarsamente differenziate, con positive implicazioni sulla loro funzionalità in vivo; in questo studio, inoltre, la presenza nel vettore LV di un promotore bidirezionale recentemente descritto ha permesso l'espressione coordinata del CAR e del gene reporter Firefly Luciferase con l'obiettivo di monitorare il destino biologico dei linfociti trasferiti adottivamente in vivo, mediante imaging di bioluminescenza (BLI).
La popolazione di PBMC ingegnerizzati con recettore chimerico (T-body) è caratterizzata da un'elevata percentuale di espressione del CAR anti-hPSMA (superiore al 50%), da un fenotipo di memoria e dalla capacità di riconoscere e lisare in modo specifico cellule esprimenti l'antigene. In un modello murino di tumore prostatico sottocutaneo i T-body si sono dimostrati efficaci solo se co-inoculati con cellule tumorali o se inoculati a livello locale, mentre il trasferimento adottivo per via sistemica non ha determinato alcun risultato terapeutico. Il monitoraggio della distribuzione in vivo dei linfociti mediante BLI ha indicato come la scarsa capacità di sopravvivenza e di homing al sito tumorale possano essere una potenziale causa del fallimento terapeutico.
I risultati positivi ottenuti in questo lavoro, in particolare lo sviluppo di un recettore chimerico anti-hPSMA di seconda generazione, l'utilizzo di vettori LV e la generazione di T-body funzionali in vitro e in vivo, costituiscono il razionale per ulteriori studi e per future applicazioni cliniche di questo tipo di approccio in pazienti con carcinoma prostatico; rimane tuttavia fondamentale chiarire le dinamiche di ricircolazione e distribuzione delle cellule T con l'obiettivo di implementarne la capacità di sopravvivere, ricircolare e raggiungere il sito tumorale, fattori indispensabili per mediare l'effettiva regressione della neoplasia.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Rosato, Antonio
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > ONCOLOGIA E ONCOLOGIA CHIRURGICA
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:29 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):Chimeric Antigen Receptor, lentiviral vectors, adoptive immunotherapy
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/06 Oncologia medica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Oncologiche e Chirurgiche
Codice ID:2711
Depositato il:29 Set 2010 11:19
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