IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF PROTEINS INVOLVED IN BIOTIC STRESS RESISTANCE OF CEREALS

Leaf rust is one of the most important diseases of barley (Hordeum vulgare) and is caused by the biotrophic fungal pathogen Puccinia hordei. The rust fungi penetrate barley leaves through stomata and colonize cells of the mesophyll, then growing systemically through the leaf vascular tissue. The leaf rust resistance gene Rph15 is of outstanding interest for resistance breeding because it confers resistance to over 350 Puccinia hordei isolates collected from around the world (Weerasena et al. 2004). Plant-pathogen interactions activate many cellular signalling processes and, most likely, changes on protein accumulation and phosphorylation pattern of proteins play a pivotal role in plant responses to biotic stress. In this work, a proteomic approach was undertaken to study changes in total proteins accumulation and protein phosphorylation pattern in response to the leaf rust pathogen infection in two barley near isogenic lines, Bowman and Rph15, which differ for the introgression of the leaf rust resistance gene Rph15. Two infection time points, 24 hours and four days, were considered for the analysis. No statistically significant differences were identified at the early time point, 24 hours post infection, for total and phosphorylated proteins. At four days after inoculation, total protein analysis led to the identification of twenty-one protein spots significantly up or down regulated with a fold-change equal or higher than two following pathogen infection. Most of down-regulated proteins were found in the Rph15 near-isogenic line while no significantly differential protein abundance was recovered in the susceptible line. Nineteen out of 21 protein spots were characterized by LC-MS/MS analysis and found to be involved in photosynthesis, sugar metabolism, energy balance and defence. Phosphoproteomics analysis was performed at four day after inoculation. A phosphoprotein enrichment methodology based on MOAC (metal oxide affinity chromatography) was optimized for subsequent 2DE analyses.

La ruggine fogliare è una delle malattie più importanti della coltura dell'orzo (Hordeum vulgare) ed è causata dal patogeno fungino biotrofo Puccinia hordei. Il fungo penetra attraverso gli stomi delle foglie dell’orzo e colonizza le cellule del mesofillo, crescendo poi per via sistemica nei tessuti vascolari della foglia. Il gene Rph15 di orzo è di considerevole importanza per il miglioramento genetico della resistenza in quanto conferisce resistenza a più di 350 isolati di P. hordei provenienti da tutto il mondo (Weerasena et al. 2004). L’interazione pianta-patogeno attiva numerosi processi di signalling cellulare e, molto probabilmente, l’accumulo delle proteine e i cambiamenti nel pattern di fosforilazione delle proteine giocano un ruolo centrale nella risposta della pianta in seguito a stress biotico. In questo lavoro, un approccio di tipo proteomico è stato intrapreso per studiare i cambiamenti nei pattern proteici totali e delle proteine fosforilate in seguito a risposta alla ruggine fogliare in due linee quasi isogeniche di orzo, Bowman e la linea Rph15, che differiscono per l’ introgressione del gene Rph15. Due tempi di infezione, 24 ore e quattro giorni, sono stati presi in considerazione per le analisi. Nessuna differenza statisticamente significativa è stata individuate nel primo tempo di infezione precoce, a 24 ore dopo l’inoculo, sia per quanto riguarda le proteine totali che per le proteine fosforilate. A 4 giorni dall’infezione, l’ analisi delle proteine totali ha consentito di identificare ventuno spot proteici significativamente up o down regolati in risposta all’ infezione con un fold-change almeno di 2. La maggior parte delle proteine down-regolate sono state trovate nel campione infettato della linea isogenica contenente il gene di resistenza Rph15, mentre non è stata riscontrata alcuna differenza statisticamente significativa nel pattern proteico della linea isogenica suscettibile. Diciannove dei 21 spot proteici sono stati caratterizzati mediante analisi LC-MS/MS e identificati essere implicati in processi come fotosintesi, metabolismo degli zuccheri, bilancio energetico e risposte di difesa. L’analisi del fosfoproteoma è stata condotta a quattro giorni dopo l’inoculo. Una tecnica di arricchimento in fosfoproteine basata su MOAC (cromatografia di affinità mediante ossidi metallici) che è stata ottimizzata per la successiva analisi 2DE.