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GESIOT, LORENZO (2010) CARATTERIZZAZIONE DI DOMINI STAS DI PROTEINE DELLA FAMIGLIA SULP MEDIANTE TECNICHE DI RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

The Sulfate Permease SulP is a ubiquitous family of membrane transporters that uptake or exchange inorganic anions. In bacteria and plants, these transporters mediate the uptake of sulfate, a source of sulfur, a key element in bacterial and eukaryotic metabolism. Genes involved in sulfur metabolism have been found to be virulence determinants in mammalian pathogens. In Mycobacteria, for example, overexpression screening of several bacterial genes related to environmental stresses revealed inducible, stable accumulation of the high affinity sulfate-specific SulP transporter Rv1739c. In mammals, the SulP transporters are represented by the SLC26 family (Solute Linked Carrier). Mammalian anion transporters are versatile anion exchangers, with important roles in normal physiology and human pathophysiology. The clinical relevance of the Slc26 gene family has been highlighted with the identification of pathogenetic mutations in four genes involved in inherited human diseases (Slc26A2 - diastrophic dysplasia, Slc26A3 - congenital chloride diarrhoea, Slc26A4 - Pendred syndrome,
Slc26A5 - non-syndromic deafness).
The SulP proteins consist of a N-terminal hydrophobic core composed of a variable number of trans-membrane stretches and a C-terminal cytoplasmic portion that includes a STAS (Sulphate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist) domain. The N-terminal domain is associated with anion transport, while the function of the STAS domain remains unknown; nevertheless, in plant SulP and mammalian SLC26
transporters, STAS is considered to play a fundamental role, essential for plasma membrane targeting and transport function. Sequence analysis revealed an unexpected similarity between the C-terminal cytoplasmatic part of SulP transporters and the bacterial antisigma-factor antagonists ASA, typified by Bacillus subtilis SPOIIAA (117 aa). SpoIIAA consists of a four-strands β-sheet surrounded by four α-helices. Unlike the bacterial ASA, the STAS domains of the anion transporters are poorly characterized in terms of both their function and structure. In the STAS domains, the β-scaffold and the loop between strand β3 and helix α2 are highly conserved, while a variable loop of different length is predicted between helix α1 and strand β3 and a variable extension is present at the C-terminal. These elements indicate that, probably, the 3D structure of the anion transporters STAS domains deviates unpredictably from that of the bacterial ASA.
Thus, the structural characterization of the STAS domains of the SulP transporters family is important to understand their physiology and the role of mutations in the related pathologies. As far as the structural organization of these proteins is concerned, no three dimensional structures of domains or full-length sequences are available yet, either for mammalian SLC26 anion transporter or for other members of the SulP family.
This is the main aim of this project. In fact, the limited dimensions of the protein make it investigable by solution NMR techniques.
We focused our attention on three STAS domains, which were expressed in E. coli and studied by NMR:
1) Rv1739c STAS from Mycobacterium tuberculosis: we expressed a single 15N-labelled sample which allowed us to collect HSQC experiments of good quality; unfortunately, the protein revealed to be extremely temperature sensitive and denatured while testing different temperature conditions. However, the real trouble with this protein was the poor yield in its expression. Unfortunately, just before changing the
expression strategy to improve the expression (from a common thrombin-removable His-tag to a removable SUMO fusion domain), NMR assignment of the same protein was published.
2) SULTR1;2 STAS from Arabidopsis thaliana: we expressed a single 15N-labelled sample which allowed us to collect HSQC experiments that revealed a self-aggregation compatible with the formation of homodimers. The protein showed to be very unstable and precipitated quantitatively within few hours after the beginning of the experiments.
3) Prestin STAS from Rattus norvegicus. Prestin (SLC26A5) is highly and almost exclusively expressed in the outer hair cells (OHCs) of the organ of Corti in the inner ears of mammals; unlike the other members of the SLC26 family, it has the unique property of voltage-dependent conformational changes and it is considered the key player in the OHCs electromotility. In response to changes in the trans-membrane
voltage, the motor protein is thought to undergo a structural rearrangement that changes its area in the plasma membrane with the consequence that the cell changes its length by up to 5%. Mutations of Prestin have been shown to cause severe hearing deficit.
We were able to produce the recombinant 15N-labeled and 15N-13C-labeled STAS domain of Prestin, stable at millimolar concentration (1.2 mM) in the form of a wellfolded monomer. We collected the following 13C,15N heteronuclear NMR experiments:
HNCO, HNCA, HN(CA)CO, CBCA(CO)NH, HNCACB, H(CA)NH,
HBHA(CBCACO)NH, H(CCCO)NH, (H)CC(CO)NH, HCCH-TOCSY, CBHD, aromatic-13C-HSQC, (H)C(NC)H-His, (HB)CB(CGCC)H-TOCSY (for Tyr and Phe), 13C-NOESY (aromatic and aliphatic), 15N-NOESY. Besides, a C-detected HCACO
experiment was collected. All these experiments required about 45 days. The assignment of the backbone and the side chains is now complete for about 90% of the residues. Unfortunately this protein has some problems of conformational exchange that quenches the HN backbone signals of two stretches of residues (35-55 and 73-80).
Nevertheless, it was possible to obtain some interesting structural information.

Abstract (italiano)

Le Permeasi del Solfato (SulP) rappresentano una famiglia di trasportatori di membrana che assorbono o scambiano anioni inorganici. Nei batteri e nelle piante, questi trasportatori mediano l’assorbimento del solfato, una fondamentale fonte di zolfo, essenziale per il metabolismo di Procarioti ed Eucarioti. È stato dimostrato che alcuni geni coinvolti nel metabolismo dello zolfo costituiscono dei fattori di virulenza in alcuni patogeni di mammifero. Nei Micobatteri, ad esempio, l’analisi dell’espressione genica in risposta a stress ambientali ha dimostrato un accumulo inducibile e stabile della proteina Rv1739c, un trasportatore ad alta affinità e specifico per il solfato appartenente alla famiglia SulP. Nei mammiferi, i trasportatori SulP sono rappresentati dalla famiglia SLC26 (Solute Linked Carrier). I trasportatori di mammifero sono degli scambiatori anionici molto versatili, essenziali per normale fisiologia e coinvolti nella fisiopatologia umana. La rilevanza clinica della famiglia Slc26 è stata evidenziata con l’identificazione di mutazione patogeniche in quattro geni coinvolti in patologie ereditarie (Slc26A2 - displasia diastrofica, Slc26A3 - diarrea congenita con perdita di cloruro, Slc26A4 - sindrome di Pendred, Slc26A5 - sordità non sindromica).
Le proteine SulP sono costituite da una regione idrofobica N-terminale composta da un numero variabile di segmenti trans-membrana e da una porzione C-terminale citoplasmatica che include un dominio STAS (Sulphate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist). Il dominio N-terminale è associato al trasporto anionico, mentre la funzione del dominio STAS rimane sconosciuta; ciononostante, nei trasportatori SulP
vegetali e SLC26 di mammifero, lo STAS è considerato fondamentale per il corretto indirizzamento verso la membrana plasmatica e per la funzione di trasporto. L'analisi di sequenza ha dimostrato un’inattesa similarità tra la regione citoplasmatica C-terminale dei trasportatori SulP e le proteine batteriche ASA (AntiSigma-factor Antagonist), caratterizzate grazie alla determinazione strutturale di SPOIIAA (117 aa) di Bacillus subtilis. SpoIIAA presenta un foglietto β costituito da quattro filamenti, circondato da quattro α-eliche. A differenza degli ASA batterici, i domini STAS dei trasportatori anionici sono scarsamente caratterizzati per quanto riguarda sia la loro funzione, sia la loro struttura. Nei domini STAS, il foglietto β e il loop compreso tra il filamento β3 e l’elica α2 sono molto conservati, mentre, a livello del loop compreso tra l’elica α1 e il filamento β3 e in posizione C-terminale, sono previste delle estensioni variabili di differente lunghezza. Queste osservazioni indicano che, probabilmente, la struttura
tridimensionale dei domini STAS dei trasportatori anionici devia in modo imprevedibile da quella degli ASA batterici. Pertanto, la caratterizzazione strutturale degli STAS della
famiglia SulP è fondamentale per comprenderne la fisiologia e il ruolo che le mutazioni hanno nell’insorgere delle patologie. Attualmente non è disponibile alcuna struttura tridimensionale sperimentale né dei trasportatori SulP, né dei loro domini. La
determinazione strutturale dei domini STAS è il principale scopo di questo progetto. In effetti, le dimensioni limitate di queste proteine le rendono studiabili mediante tecniche
di NMR in soluzione.
I domini STAS delle proteine presentate qui di seguito sono stati espressi in E. coli e studiati mediante NMR:
1) STAS di Rv1739c da Mycobacterium tuberculosis: abbiamo espresso un campione marcato con l’isotopo 15N, che ci ha consentito di raccogliere esperimenti HSQC di ottima qualità; la proteina tuttavia si è dimostrata estremamente sensibile alla temperatura e si è denaturata mentre venivano testate diverse condizioni. Il principale problema con questa proteina è comunque stata la bassa resa ottenuta dalla sua espressione. Sfortunatamente, poco prima di cambiare strategia di clonaggio (passando da una comune His-tag rimuovibile con trombina ad un dominio di fusione SUMO
rimuovibile), l’assegnazione NMR della stessa proteina è stata pubblicata.
2) STAS di SULTR1;2 da Arabidopsis thaliana: abbiamo espresso un campione marcato con l’isotopo 15N, che ci ha consentito di raccogliere esperimenti HSQC che hanno dimostrato un livello di aggregazione compatibile con la formazione di omodimeri. La proteina si è dimostrata molto instabile ed è precipitata in modo massivo entro poche ore dall’inizio degli esperimenti.
3) STAS di Prestina da Rattus norvegicus. La Prestina (SLC26A5) è espressa in grandi quantità e in modo quasi esclusivo nelle cellule cigliate esterne OHC (Outer Hair Cell) dell’organo del Corti, nell’orecchio interno dei mammiferi; a differenza degli altri membri della famiglia SLC26, ha la proprietà unica di subire modificazioni conformazionali voltaggio-dipendenti, ed è considerata fondamentale nell’elettromotilità delle cellule OHC. In risposta a variazioni del voltaggio trans-membrana, agisce come un motore molecolare, subendo riarrangiamenti strutturali che ne alterano la sezione nella membrana plasmatica, modificando di conseguenza la lunghezza cellulare di anche il 5%. Mutazioni della Prestina sono state individuate come la causa
di gravi deficit uditivi. Abbiamo prodotto un campione di STAS marcato con 15N e un campione doppiamente marcato con 15N e 13C; questo dominio si è dimostrato stabile alle
concentrazioni millimolari (1.2 mM), nella forma di un monomero ben strutturato.
Abbiamo raccolto i seguenti esperimenti NMR 13C,15N-eteronucleari: HNCO, HNCA, HN(CA)CO, CBCA(CO)NH, HNCACB, H(CA)NH, HBHA(CBCACO)NH, H(CCCO)NH, (H)CC(CO)NH, HCCH-TOCSY, CBHD, 13C-HSQC per gruppi aromatici, (H)C(NC)H-His, (HB)CB(CGCC)H-TOCSY (per Tyr e Phe), 13C-NOESY (per gruppi aromatici and alifatici), 15N-NOESY, oltre ad un C-detected HCACO. Tutti questi esperimenti hanno richiesto un tempo macchina di oltre 45 giorni. L’assegnazione della catena principale e delle catene laterali è completa per circa il 90% dei residui.
Purtroppo questa proteina presenta alcuni problemi di scambio conformazionale che ne sopprimono i segnali dei gruppi HN in catena principale di due sequenze (35-55 and 73-
80). È stato tuttavia possibile fare alcune interessanti considerazioni di tipo strutturale.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:MAMMI, STEFANO
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > BIOCHIMICA E BIOTECNOLOGIE > BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:29 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):STAS, NMR
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/10 Biochimica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chimiche
Codice ID:2800
Depositato il:20 Set 2010 10:37
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Bibliografia

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