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Zampese, Enrico (2010) PRESENILIN-2 AND CALCIUM HANDLING IN FAMILIAL ALZHEIMER'S DISEASE:
A GENETICALLY ENCODED Ca2+ PROBES-BASED STUDY
ROLE OF PS2 STRUCTURE, ER Ca2+-LEAK PATHWAYS AND ER-MITOCHONDRIA INTERPLAY.
[Ph.D. thesis]

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PDF Document (PhD thesis Enrico Zampese) - Updated Version
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Abstract (english)

Calcium (Ca2+) is a key second messenger in living cells and it regulates a multitude of
cell functions; this means as well that a dysregulation in its signaling cascade can be
detrimental for cell fate. Ca2+ mishandling has been proposed as a causative mechanism for
most neurodegenerative diseases and in particular for Alzheimer’s Disease (AD).
From the middle ‘80s, alterations in Ca2+ dynamics were noticed in fibroblasts from AD
patients, but extensive studies on AD and Ca2+ homeostasis started only after the identification
of mutations linked to Familial Alzheimer’s Disease (FAD) in three genes, app, psen-1 and
psen-2, coding for Amyloid Precursors Protein (APP), Presenilin-1 and Presenilin-2 (PS1,
PS2).
Mutations in these genes caused alterations in the cleavage of APP by a PS1- or PS2-
containing enzyme, thus leading to an increase in the ratio between the two main peptides
finally derived from APP maturation, called Ab40 and Ab42, in favor of the latter, the most
toxic and most prone to aggregation specie; this in turn would increase the deposition of
“Amyloid Plaques”, one of the principal histopathological feature of AD. Up to now, the
generation of Ab42 peptides, its oligomers and finally amyloid plaques is the core of the most
widely accepted pathogenic hypothesis for AD, the “Amyloid Cascade Hypothesis”.
Considering Ca2+ homeostasis, most of the attention has been paid to the effect of PS1
(and only lately of PS2) mutations. Initially, most works reported an increase in the Ca2+
released in the cytosolic compartment from ER upon stimulation in cells expressing FADPS(
1), thus suggesting an increase in ER Ca2+ loading, the “Ca2+ Overload Hypothesis”.
Although supported by several groups for many years, this hypothesis has never been
undisputedly accepted, since some data were clearly in contrast with it, especially those
considering PS2 mutations.
Recently a strong evidence in support of “Ca2+ overload hypothesis” came from works
suggesting that wt PSs can form low conductance Ca2+ channels in the ER membrane,
providing most of the constitutive Ca2+ leak from the organelle; this function would be
compromised by FAD mutations, that would thus lead to an ER Ca2+ overload. Again, these
data have not been collectively accepted and other groups provided alternative explanations
for the enhanced Ca2+ release in FAD-PSs (mostly PS1) expressing cells, such as enhanced
Ryanodine Receptor (RyR) activation, augmented IP3 Receptor (IP3R) opening probability or
potentiated SERCA activity. Interestingly, some of these data were no more suggesting an
increased ER Ca2+ content (and so what is properly named “Ca2+ overload”) but rather an
exaggerated Ca2+ release from the store, with unchanged (or even reduced) ER Ca2+
concentration.
The effect of PS2 mutations has been less studied and is more controversial. Fibroblasts
from patients bearing PS2 mutations showed reductions in Ca2+ release upon stimulation and
actually data obtained by employing ER-targeted Ca2+ probes (e.g. ER-targeted aequorin) in
FAD-PS2 stable clones, as well as cell lines transiently-transfected with different FAD-PS2
mutations, showed a reduction in ER Ca2+ concentration.
Starting from these results, demonstrating that the expression of PS2 bearing FAD-linked
mutations dampens the intracellular Ca2+ stores, the molecular mechanisms behind this
phenomenon have been taken under investigation.
In particular, three different aspects of PS2 effect on Ca2+ handling have been analyzed,
mostly employing organelle-targeted aequorin Ca2+ probes: (i) the role of PS2 conformation
on its effect in reducing the ER Ca2+ level; PSs are in fact synthesized as holoprotein but soon
after their incorporation into g-secretase complex undergo a maturation cleavage to their
active, dimeric form; ii) the involvement of the Ca2+ leak pathway across the ER membrane in
PS2’s effect and more specifically of three different possible leak pathways proposed by
literature, RyR, IP3R and the Ribosomal-Translocon complex (RTC); (iii) the role of PS2 in
regulating the interplay between ER and mitochondria, a critical feature in cell life.
Experiments on cells devoid of endogenous PS1 and PS2 and transfected with different
PS2 constructs (resulting in the expression of the full length PS2, the dimeric PS2 or both)
demonstrated that the full length conformation of this protein is necessary for the reduction in
ER Ca2+ level linked to its expression; moreover, it has been shown that increasing, by
different approaches, the endogenous level of the full length PS2 decreases ER Ca2+ content.
Data aimed at measuring the decay rate of ER Ca2+ in control cells compared with FADPS2
expressing cells revealed an increased Ca2+ leak in the latter, and so the possible
involvement of RyR, IP3R and RTC was investigated both by pharmacological (application of
RyR inhibitor Dantrolene, IP3R antagonist Heparin, RTC opener/closer
Puromycin/Anisomycin) or genetic (siRNA against IP3R-1 and -3 isoforms) approaches,
showing that the PS2-induced ER Ca2+ reduction is at least partially mediated by RyR and
IP3R, but not by RTC.
Mitochondrial uptake of Ca2+ released from ER was evaluated. When mitochondrial Ca2+
peaks were measured in PS2-expressing and control cells in a condition in which their
cytosolic peaks were comparable (by partially pre-emptying control cells), an increase in
mitochondrial Ca2+ uptake was observed for cells over-expressing PS2 wt and, more
prominently, FAD-PS2. This was not due to a direct effect of PS2 on mitochondrial uptake
machinery but to an increased interaction between these organelles and the ER, as
demonstrated by evaluating the two organelles proximity by confocal microscopy. By downregulating
PS2 with siRNA, it was also shown that endogenous PS2 can control ERmitochondria
interaction. These results were confirmed by employing FRET-based
“Cameleon” cytosolic and mitochondrial Ca2+ probes on single-cells experiments.
Altogether these findings provide new insights into the PS2 effect on Ca2+ homeostasis in
Familial Alzheimer’s Disease and, more specifically, on the role of PS2 conformation and on
the involvement of RyR and IP3R in its effect. A new aspect of the PS2 control of cell (and in
particular Ca2+) dynamics is also emerging since it is here shown, for the first time, that this
protein can influence the interplay between ER and mitochondria and that FAD-mutations
affect this interaction, opening new directions for the investigation of the effects of PSs’
mutations in Familial Alzheimer’s Disease.

Abstract (italian)

Il calcio (Ca2+) è un secondo messaggero chiave nelle cellule e regola una moltitudine di
funzioni cellulari; questo significa che una dis-regolazione nella sua cascata di trasduzione del
segnale può essere deleteria per il destino della cellula. Difetti nella regolazione del Ca2+ sono
stati proposti come possibili cause della maggior parte delle malattie neurodegenerative e in
particolare della Malattia di Alzheimer (AD).
Sin dalla metà degli anni ’80 furono notate alterazioni nelle dimamiche intracellulari del
Ca2+ in fibroblasti ottenuti da pazienti affetti da AD, ma studi sistematici sulla relazione tra
AD e omeostasi del Ca2+ cominciarono solo dopo l’identificazione di mutazioni legate alle
forme familiari di AD (FAD) a carico di tre geni, app, psen-1 e psen-2, codificanti per la
Proteina Precursone dell’Amiloide (APP), Presenilina-1 e Presenilina-2 (PS1, PS2).
Mutazioni in questi geni causano alterazioni nel taglio di APP ad opera di un enzima
contenente PS1 o PS2, le quali comportano quindi un aumento nel rapporto tra i due principali
peptidi derivanti dalla maturazione di APP, chiamati Ab40 e Ab42, in favore di quest’ultimo,
la specie più tossica e con maggiore tendenza all’aggregazione; questo d’altra parte aumenta
la deposizioni delle “Placche Amiloidi”, una delle caratteristiche istopatologiche dell’AD.
Attualmente, la generazione dei peptidi Ab42, dei suoi oligomeri e infine delle placche
amiloidi è alla base della principale ipostesi sulla patogenesi dell’AD, l’“Amyloid Cascade
Hypothesis”.
Riguardo l’omeostasi del Ca2+, la maggior parte dell’attenzione è stata rivolta all’effetto
delle mutazioni in PS1 (e solo successivamente in PS2). Inizialmente la maggior parte dei
lavori riportava un incremento degli aumenti citosolici di Ca2+ indotti dalla stimolazione del
rilascio dal reticolo endoplasmatico (ER) in cellule esprimenti mutazioni in PS1 associate a
FAD (FAD-PS1), e perciò suggerivano un aumento nel contenuto di Ca2+ del ER, “Ca2+
Overload Hypothesis”. Nonostante sia stata sostenuta da molti gruppi per diversi anni questa
ipotesi non è mai stata indiscutibilmente accettata, poiché esistevano alcuni dati
evidentemente in contrasto con essa, soprattutto considerando mutazioni a carico di PS2.
Recentemente l’ipotesi del “Ca2+ Overload” ha ricevuto forte supporto dalla
dimostrazione che le PS nella loro forma wild type (wt) formano canali a bassa conduttanza
per il Ca2+ nella membrana del ER, rappresentando la maggior parte della via di fuga (leak)
costitutiva del Ca2+ dallo stesso organulo; questa funzione sarebbe compromessa dalle
mutazioni associate a FAD, che quindi porterebbero ad un sovraccarico di Ca2+ nel ER.
Anche in questo caso, questi dati non sono stati universalmente accettati e altri gruppi hanno
fornito spiegazioni alternative all’aumentato rilascio di Ca2+ nelle cellule esprimenti
mutazioni associate a FAD a carico delle PS (soprattutto PS1), cioè un’aumentata attivazione
del Recettore Rianodinico (RyR), una maggiore probabilità di apertura del Recettore dell’IP3
(IP3R) o un potenziamento dell’attività della Ca2+-ATPasi del ER (SERCA). È interessante
osservate che alcuni di questi dati non riportano più un aumento nel contenuto di Ca2+ del ER
(cioè quello che è propriamente definito “Ca2+ Overload”) ma piuttosto un rilascio esagerato
di Ca2+ dallo stesso deposito, con una concentrazione al suo interno inalterata o persino
diminuita.
L’effetto delle mutazioni in PS2 è stato meno studiato ed è più dibattuto. Fibroblasti
ottenuti da pazienti affetti da mutazioni FAD in PS2 hanno rivelato un ridotto rilascio di Ca2+
dal ER in seguito a stimolazione, e dati ottenuti utilizzando sonde in grado di misurare
direttamente la concentrazione di Ca2+ nel ER (in particolare basate su equorina modificata
indirizzata al ER) hanno dimostrato una diminuzione nella concentrazione di Ca2+ nel ER sia
in cloni stabili che in linee cellulari esprimenti mutazioni FAD in PS2.
A partire da questi risultati, i quali dimostrano che l’espressione di PS2 recanti mutazioni
associate a FAD riduce il contenuto di Ca2+ dei depositi intracellulari, si è deciso di
investigare i meccanismi molecolari alla base di questo fenomeno.
In particolare, sono stati investigati, soprattutto mediante l’impiego di equorine indirizzate
a diversi compartimenti cellulari, tre diversi aspetti dell’effetto di PS2 sull’omeostasi del
Ca2+: i) il ruolo della conformazione di PS2 nel suo effetto di riduzione del livello di Ca2+ del
ER; le PS sono infatti sintetizzate come proteine intere ma subiscono rapidamente una
maturazione mediante taglio ad una forma dimerica quando sono incorporate nel complesso g-
secretasico; ii) il coinvolgimento del leak di Ca2+ attraverso la membrane del ER nell’effetto
di PS2, e più in particolare di tre diverse possibili “vie di fuga” suggerite in letteratura, RyR,
IP3R e il complesso Ribosoma-Traslocone (RTC); iii) il ruolo di PS2 nell’interazione tra ER e
mitocondri, un aspetto centrale nella fisiologia della cellula.
Esperimenti su cellule prive di PS1 e PS2 endogene transfettate con diversi costrutti di
PS2 (in grado di dare l’espressione di PS2 intera, dimerica o di entrambe) hanno dimostrato
che la sua conformazione intera è necessaria per la riduzione del contenuto di Ca2+ del ER
indotta da PS2; inoltre, è stato dimostrato che un aumento nel livello endogeno di PS2 intera
diminuisce il livello di Ca2+ nel ER.
Dati mirati a misurare la velocità di uscita del Ca2+ attraverso la membrana del ER hanno
evidenziato un leak di ioni Ca2+ aumentato in cellule esprimenti PS2 associate a FAD rispetto
ai controlli, e quindi si è investigato il possibile coinvolgimento di RyR, IP3R e RTC sia con
approcci di tipo farmacologico (impiego dell’inibitore di RyR Dantrolene, dell’antagosista di
IP3 Eparina, di Puromicina e Anisomicina, due agenti che bloccano RTC in conformazione
aperta o chiusa rispettivamente) che di tipo genetico (siRNA contro le isoforme 1 e 3 di IP3R
al fine di diminuirne il livello proteico), arrivando a dimostrare che la riduzione del contenuto
di Ca2+ del ER indotta da PS2 è almeno parzialmente mediata da RyR e IP3R ma non da RTC.
È stato inoltre valutato l’accumulo da parte dei mitocondri del Ca2+ rilasciato dal ER.
Quando sono stati misurati i picchi di Ca2+ mitocondriale in cellule esprimenti PS2 e cellule di
controllo in condizioni in cui il rilascio citosolico era confrontabile (le cellule di controllo
venivano parzialmente pre-svuotate) si è osservato un aumento nella captazione di Ca2+ da
parte dei mitocondri in cellule esprimenti PS2 wt e, in modo più pronunciato, PS2 associata a
FAD. Questo fenomeno non è dovuto a un effetto diretto di PS2 sul meccanismo di ingresso
di Ca2+ nei mitocondri, bensì ad un aumento nell’interazione tra i mitocondri stessi e il ER,
come è stato dimostrato misurando la prossimità dei due organuli mediante microscopia
confocale. L’abbattimento dei livelli proteici di PS2 grazie a siRNA ha inoltre evidenziato che
la PS2 endogena può controllare il grado di interazione tra ER e mitocondri. Questi risultati
sono stati infine confermati da esperimenti fatti con sonde “Cameleon” per il Ca2+, basate sul
fenomeno del FRET.
Complessivamente questi dati forniscono nuovi elementi sull’effetto di PS2
sull’omeostasi del Ca2+ nelle forme familiari della Patologia di Alzheimer e, più in dettaglio,
sul ruolo della conformazione di PS2 e sul coinvolgimento di RyR e IP3R nel suo effeto. Un
nuovo aspetto del controllo da parte di PS2 sulle dinamiche cellulari (e del Ca2+ in particolare)
viene inoltre riportato per la prima volta, cioè che questa proteina può regolare la relazione tra
ER e mitocondri, e che mutazioni FAD a suo carico influenzano questa interazione; questo
suggerisce ovviamente nuove possibili vie di indagine sull’effetto delle mutazioni a carico
delle PS nelle forme familiari di AD.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Paola, Pizzo
Ph.D. course:Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > BIOSCIENZE > NEUROBIOLOGIA
Data di deposito della tesi:UNSPECIFIED
Anno di Pubblicazione:29 January 2010
Key Words:Presenilin-2, calcium, Alzheimer's Disease, Endoplasmic Reticulum, Mitochondria
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/04 Patologia generale
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali
Codice ID:2837
Depositato il:21 Sep 2010 10:09
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