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Biasiotto, Roberta (2010) Functional characterization of the p13 protein of HTLV-1. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

HTLV-1 is the causative agent of adult T-cell leukemia-lymphoma (ATLL), an aggressive neoplasm of mature CD4+ T cells refractory to current therapies, and of HAM/TSP, a neurodegenerative disease. HTLV-1 is a complex retrovirus whose genome encodes several regulatory and accessory proteins (Rex, Tax, HBZ, p12, p30, p13) in addition to the structural proteins (gag, pol, env) common to all retroviruses.
Previous studies demonstrated that HTLV-1 p13, an 87-amino acid protein, is targeted to the inner membrane of mitochondria and induces mitochondrial fragmentation. In vitro studies carried out using the full-length synthetic protein and isolated mitochondria showed that p13 induces a potential-dependent potassium (K+) influx into the mitochondrial matrix, accompanied by a dose-dependent depolarization, and reduces the threshold for permeability transition pore (PTP) opening. This effect on K+ permeability is mediated by an amphipatic α-helical domain (amino acids 21-30), in which four positively charged arginines play a key role. p13 slows down cell proliferation, promotes apoptosis triggered by ceramide and Fas L, and interferes with tumor growth in experimental models.
The studies described in the present thesis were aimed at testing the effects of p13 on mitochondria in living cells. Using the potential-dependent probe tetramethyl rhodamine methyl ester (TMRM), we demonstrated that p13 induces dose-dependent mitochondrial depolarization of HeLa cells. The p13RQ mutant, which is inactive on K+ permeability, had no effect on mitochondrial membrane potential (∆ψ). Similar results were obtained with Jurkat T-cells. As ∆ψ is a key factor controlling mitochondrial calcium (Ca2+) uptake, we analyzed the effect of p13 on Ca2+ homeostasis. To this end, we employed organelle-targeted aequorin and showed that p13 specifically reduced mitochondrial Ca2+ uptake, upon histamine stimulation, while it does not alter Ca2+ concentration in the cytoplasm or the endoplasmic reticulum (ER). This effect suggests that p13 might control key processes regulated through Ca2+ signalling, such as T-cell activation and death.
The observation that p13's effect on ∆ψ was heterogeneous at intermediate levels of expression suggested the existence of mechanisms regulating p13 function. In the present study, we investigated the possible role of phosphorylation in the regulation of p13 function. In particular, we focused on serine 15 (S15), a putative protein kinase C (PKC) phosphorylation site located in the proximity of the α-helical domain. In vitro phosphorylation assays on p13[9-22] and p13S15A[9-22] synthetic peptides confirmed the phosphorylation of S15 by purified PKC and by cytosolic and mitochondrial lysates from Jurkat T-cells as a source of kinases. We also confirmed the in vitro phosphorylation of the full-length synthetic p13 by Jurkat T-cell lysates. Preliminary results obtained by 2D-electrophoresis analysis of Jurkat T-cells transiently transfected with p13 demonstrated that the protein is detected in two main forms differing in their pI. We then analyzed the functional effects of S15 phosphorylation by producing the phosphoablative (p13S15A) and phosphomimetic (p13S15D) mutants and studying their properties in HeLa cells. Results demonstrated that the presence of a negative charge on residue 15 enhances the effect of p13 on the induction of mitochondrial fragmentation. Interestingly, using TMRM, we found that the phosphomimetic mutant induces mitochondrial depolarization at much lower level of expression, compared to p13 wild-type. Taken together, these results suggest that phosphorylation on S15 might influence the biological properties of p13, and open the door to future studies of this and other cellular mechanisms regulating p13 function.

Abstract (italiano)

Il virus T-linfotropico umano di tipo 1 (HTLV-1) è associato all'insorgenza della leucemia-linfoma a cellule T dell'adulto (ATLL), un'aggressiva neoplasia dei linfociti T CD4+ maturi, e della mielopatia associata ad HTLV-1/paraparesi spastica tropicale (HAM/TSP), una patologia degenerativa del sistema nervoso centrale. HTLV-1 è classificato come retrovirus complesso in quanto il suo genoma codifica, oltre a proteine strutturali (gag, env, pol), anche proteine regolatorie (Tax e Rex) ed accessorie (p30, p12, p13, HBZ), dalla funzione ancora non del tutto chiarita.
Precedentamente è stato dimostrato che la proteina accessoria p13 (la cui sequenza è costituita da 87 aminoacidi) si localizza nella membrana mitocondriale interna ed induce marcata frammentazione di questi organelli. Mediante studi in vitro condotti con p13 sintetica e mitocondri isolati è stato dimostrato che p13 induce un influsso di potassio (K+) potenziale-dipendente all'interno della matrice mitocondriale. L'alterazione della permeabilità mitocondriale indotta da p13 è accompagnata da una depolarizzazione dose-dipendente e da una riduzione della soglia di apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (PTP). L'influsso di K+ è dovuto alla presenza di un dominio anfipatico ad α-elica (tra gli aminoacidi in posizione 21 e 30), in cui le quattro arginine in posizione 22, 25, 29 e 30 svolgono un ruolo fondamentale per la funzione di p13. p13 rallenta la proliferazione cellulare, promuove l'apoptosi mediata da ceramide e Fas L e interferisce con la crescita tumorale in modelli sperimentali in vivo.
Gli studi descritti nella presente tesi sono stati mirati alla analisi degli effetti di p13 a livello mitocondriale in cellule vitali. Usando la sonda potenziale-dipendente tetrametil-rodamina-metil-estere (TMRM), è stato dimostrato che p13 induce una depolarizzazione mitocondriale dose-dipendente in cellule HeLa. Il mutante p13RQ, che non altera la permeabilità della membrana interna al K+, non ha evidenziato effetti a livello del potenziale di membrana mitocondriale (∆ψ). Risultati analoghi sono stati ottenuti utilizzando cellule T come modello cellulare.
Dato che il ∆ψ è fondamentale nel controllo dell'ingresso di calcio (Ca2+) nel mitocondrio, abbiamo analizzati gli effetti di p13 nell'omeostasi del Ca2+.
A tal fine abbiamo utilizzato la sonda Ca2+-sensibile equorina, specifica per dati compartimenti cellulari. I risultati di questa analisi hanno evidenziato che, in seguito a stimolazione con istamina, l'influsso mitocondriale di Ca2+ risulta ridotto in presenza di p13, che invece non induce alterazioni nella concentrazione di Ca2+ del citoplasma e del reticolo endoplasmatico. Questo effetto suggerisce che p13 potrebbe controllare fondamentali processi, regolati da Ca2+, come l'attivazione e la morte delle cellule T.
L'osservazione dell' eterogeneità dell' effetto di p13 sul ∆ψ, a livelli intermedi di espressione, ha suggerito l'esistenza di meccanismi preposti alla regolazione della funzione della proteina. Abbiamo quindi analizzato il ruolo della fosforilazione come possibile evento regolativo della funzione di p13. In particolare, è stata individuata la serina in posizione 15 come possibile sito di fosforilazione da parte di protein-chinasi C (PKC). S15 potrebbe essere un sito chiave per la regolazione della funzione di p13 poiché è localizzata vicino al dominio funzionale ad α-elica, responsabile dell'influsso di K+ nella matrice mitocondriale. Saggi di fosforilazione in vitro condotti sui peptidi sintetici p13[9-22] e p13S15A[9-22] hanno confermato la fosforilazione di S15 da parte di lisati cellulari (mitocondriale e citosolico) di cellule T Jurkat, oltre che da parte di una miscela commerciale di PKC, come fonte di chinasi. La reazione di fosforilazione in vitro da parte di lisati cellulari è stata anche confermata sulla proteina sintetica p13[1-87]. Risultati preliminari ottenuti mediante esperimenti di elettroforesi bidimensionale di lisati di cellule T Jurkat trasfettate transientemente con p13 hanno dimostrato che la proteina, espressa in cellule T, esiste in due forme principali, che differiscono per punto isoelettrico (pI). Sono stati inoltre analizzati gli effetti funzionali della fosforilazione di S15 producendo dei mutanti fosfomimetico (p13S1D) e fosfoablativo (p13S15A) e studiando le loro proprietà in cellule HeLa. I risultati di questi studi hanno evidenziato che la presenza della carica negativa nel residuo 15 rafforza gli effetti di p13 nell'induzione della frammentazione mitocondriale. Mediante saggi di incubazione con TMRM è stato dimostrato che il mutante fosfomimetico induce depolarizzazione mitocondriale ad un livello di espressione inferiore rispetto alla proteina wild-type. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che la fosforilazione in S15 possa influenzare le proprietà biologiche di p13. Questo studio apre la strada ad ulteriori indagini, finalizzate all'analisi di questo e di altri meccanismi alla base della regolazione della funzione di p13.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Ciminale, Vincenzo
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > ONCOLOGIA E ONCOLOGIA CHIRURGICA
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:29 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):HTLV-1 calcium mitochondrial membrane potential phosphorylation
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/06 Oncologia medica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Oncologiche e Chirurgiche
Codice ID:2853
Depositato il:29 Set 2010 09:56
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