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CASELLA, CINZIA (2010) STRATEGIES FOR THE IDENTIFICATION OF ALLELES INVOLVED IN HEREDITARY BREAST CANCER. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Breast cancer is the most common malignancy affecting women in the Western world. At present, several risk factors have been identified and, among them, the most significant is a positive family history for the disease due to the presence of inherited predisposing germline alterations. Despite the discovery of many susceptibility genes, among which the highly penetrant BRCA1 and BRCA2 are the most relevant, more than 70% of the genetic predisposition to breast cancer remains unexplained.
During my three-years Ph.D., I used different analytical approaches to investigate DNA alterations and loci that could be relevantly implicated in the aetiology and progression of hereditary breast cancers.
As first project on non informative BRCA1/2 families, I was involved in the assessment of the pathogenetic role of the BRCA1 p.Val1688del allele, which recurs in the Northeast Italy. Unclassified variants (UVs) provide a considerable challenge in the clinical management of high-risk families. Indeed, the absence of conclusive data on UVs pathogenicity, due to the lack of an evident deleterious effect on protein function, prevents their use in the identification of individuals predisposed to breast cancer development. To assess the pathogenetic role of BRCA1 p.Val1688del, we used the integrated multifactorial likelihood model described by Goldgar et al. (2004). Several independent evidences were derived from epidemiologic and linkage studies as well as histopathology, LOH and evolutionary conservation analyses, in 12 families carrying the p.Val1688del allele. All the evidences were than properly evaluated to obtain, from each, the probability of the observed data given that the variant is a deleterious mutation, against the probability of the observed data under the hypothesis that the variant is neutral. The likelihood ratios were integrated to obtain a combined odd of variant causality, resulting in a clear assessment of the BRCA1 p.Val1688del pathogenicity. Indeed, the final integrated odd of 349,000:1 in favor of disease causality largely exceeds the established cut off 1,000:1 needed to state the deleterious effect of the variant.
The second project, described herein, focused on the identification of molecular alterations involved in non-BRCA1/BRCA2 breast cancers. To this purpose, I performed a comprehensive genomic profile of the breast cancer cell line HCC1500, which was established from a patient who probably harboured a predisposing germline mutation affecting genes other than BRCA1 and BRCA2. Indeed, despite the early age of disease development and a positive family history for breast and colon cancer, we did not detect any deleterious BRCA1, BRCA2 or TP53 alteration. The HCC1500 cell line was analysed by two complementary approaches: i) a novel combined strategy named GINI (Gene Identification by NMD Inhibition; Noesie and Dietz, 2001) for the identification of nonsense mutations at the transcriptome level, and ii) a copy number alteration (CNA) analysis that was achieved by array-based high-density SNP genotyping. This approach led to the identification of genes specifically mutated by either point mutations or major genomic rearrangements. In particular, we identified an intronic substitution in the PNLIPRP3 gene, which is predicted to create a PTC by altering pre-mRNA splicing. Moreover, high-resolution CNA analysis allowed the detection of small homozygously deleted regions as well as focal amplifications, involving single or few genes. A gene selection based on the specific biological function and/or type of mutation and/or previously reported involvement in cancer pathways, allowed the definition of a relatively small number of candidate breast cancer genes that will deserve further and more specific investigation.

Finally, among the minor research projects that I will not discuss in my thesis, I was also directly involved in studies carried out by our research group as part of an international consortium, named CIMBA (Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2), whose aim is the identification of genetic factors implicated in the modification of BRCA1 and BRCA2 penetrance (Chenevix-Trench et al., 2007). Candidate single nucleotide polymorphisms (SNPs), most of which derived from genome-wide association studies, were genotyped in 213 BRCA1/2 mutation carriers from our cohort by the taqman allele discrimination technique, and subsequently statistically analyzed together with the data obtained from more than 30 study groups world-wide. The genotyping of SNP alleles in thousands of BRCA1/BRCA2 mutation carriers provide the necessary statistical power for the identification of significant association between common SNPs with typical low effects and specific subclasses of individuals at higher risk. These studies were carried out on more than 9400 BRCA1 and 5600 BRCA2 mutation carriers and allowed the identification of a significant association between rs3817198 in LPS1 and rs13387042 at 2q35 (already found to be associated with increased breast cancer risks in the general population) and increased breast cancer risk in BRCA2 and both BRCA1 and BRCA2 mutation carriers, respectively. The identification of genetic modifiers of breast cancer risk not only will favor a better understanding of breast cancer predisposition and pathogenesis but will also allow more precise cancer risk estimates and will represent a useful tool for the design of new therapeutic approaches.

Abstract (italiano)

Il tumore della mammella e’ la neoplasia più frequente nelle donne dell’Occidente. Ad oggi sono stati identificati alcuni fattori di rischio per lo sviluppo della neoplasia mammaria, ma il maggiormente significativo è la presenza di storia familiare, che è associata alla presenza nei membri della famiglia di alterazioni germinali predisponenti. Fino ad oggi sono stati identificati alcuni geni responsabili dell’aumento di rischio per lo sviluppo del tumore della mammella, tra cui i più rilevanti sono i geni ad alta penetranza BRCA1 e BRCA2. Tuttavia più del 70% dell’eccesso di rischio che si riscontra in casi familiari di tumore della mammella rispetto la popolazione generale non trova ad oggi un riscontro in alterazioni genetiche predisponenti.
Durante il mio dottorato mi sono occupata dell’identificazione di alterazioni genetiche coinvolte nella predisposizione e progressione del tumore eredo-familiare della mammella in cui sono state escluse mutazioni chiaramente patogenetiche dei geni BRCA1/BRCA2.
In un primo progetto ho partecipato alla caratterizzazione del ruolo patogenetico della variante BRCA1 p.Val1688del, identificata come variante di incerto significato clinico (Unclassified Variant, UV) e riscontrata frequentemente in pazienti provenienti dalla regione Veneto. In assenza di un chiaro effetto deleterio sulla funzionalità della proteina, le UV non possono essere utilizzate per l’identificazione e la sorveglianza degli individui ad alto rischio per lo sviluppo della neoplasia mammaria. Allo scopo di chiarire il ruolo patogenetico della delezione p.Val1688del, abbiamo utilizzato un approccio multi fattoriale, descritto da Golgar et al. (2004), attraverso il quale evidenze di diversa natura vengono integrate per derivare un rapporto di probabilità in favore della patogenicità o neutralità della variante. A questo scopo, i membri di 12 famiglie portatrici della variante sono stati analizzati per ottenere dati quali la co-segregazione della variante con il fenotipo tumorale, la co-presenza di mutazioni patogenetiche nel gene BRCA1, l’istopatologia del tumore, la perdita di eterozigosi (LOH) e la conservazione filogenetica del residuo aminoacidico alterato. Assunta l’indipendenza delle evidenze raccolte, i rapporti di probabilità associati a ciascuna evidenza sperimentale e clinica sono stati combinati, ottenendo un valore di 349000:1 in favore del ruolo patogenetico della variante, che supera di molto il cut off di 1000:1 stabilito per poter classificare la variante come alterazione predisponente.
Il secondo progetto di cui mi sono occupata riguarda la definizione del profilo genetico della linea cellulare di carcinoma mammario HCC1500, derivata da una paziente con probabile tumore eredo-familiare della mammella. Nonostante l’età precoce di insorgenza e la storia familiare di tumore della mammella e del colon, il coinvolgimento dei geni BRCA1, BRCA2 e TP53 è stato escluso mediante screening mutazionale. La linea HCC1500 è stata quindi analizzata mediante due approcci complementari: i) l’identificazione di mutazioni nonsenso mediante l’utilizzo di un’approccio di analisi recentemente descritto chiamato GINI (Gene Identification by NMD Inhibition; Noesie and Dietz, 2001), e ii) l’identificazione di alterazioni numeriche mediante l’utilizzo di array per la genotipizzazione di un elevato numero di SNP, una recente tecnologia che permette un’elevata risoluzione di analisi. Mediante questo approccio è stato possibile identificare singoli geni mutati con specifiche alterazioni puntiformi o a causa di più estesi riarrangiamenti genomici. In particolare, nel gene PNLIPRP3 abbiamo identificato una sostituzione intronica che, modificando lo splicing del pre-mRNA, potrebbe dare origine ad un trascritto con mutazione troncante. Inoltre, l’elevata risoluzione dell’analisi per lo studio delle alterazioni cromosomiche numeriche, ci ha permesso di identificare singoli o pochi geni coinvolti in delezioni in omozigosi, amplificazioni di piccole regioni e riarrangiamenti intragenici derivanti da eventi di amplificazione o delezione. Sulla base di criteri quali la funzione biologica e mutazioni ritenute rilevanti per la selettività con cui alterano specifiche regioni codificanti, abbiamo selezionato alcuni geni che, prioritariamente ad altri, andrebbero confermati e analizzati in maggior dettaglio con ulteriori studi..

Un terzo progetto che ho seguito direttamente, ma che comunque non tratterò nella mia tesi, riguarda l’identificazione di fattori genetici coinvolti nella modificazione del rischio per i soggetti portatori di mutazione BRCA1 e BRCA2. Tale progetto si inserisce nell'ambito di un consorzio internazionale, denominato CIMBA (Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2; (Chenevix-Trench et al., 2007). SNP identificati prevalentemente attraverso studi di associazione genome-wide sono stati genotipizzati in 213 carriers di mutazione BRCA1/2 della nostra casistica mediante discriminazione allelica con sonde TaqMan. L’analisi statistica è stata effettuata sui dati genotipici provenienti da più di 30 gruppi di lavoro, permettendo la raccolta di dati derivanti da migliaia di individui. In questo modo è possibile ottenere la potenza statistica necessaria per l’identificazione dell’associazione tra polimorfismi con debole effetto e un aumentato rischio di sviluppo del tumore della mammella in specifiche sottoclassi di soggetti già portatori di mutazione nei geni ad alta penetranza BRCA1/2. Effettuati su più di 9400 e 5600 carriers di mutazione rispettivamente di BRCA1 e BRCA2, tali studi hanno permesso di identificare un’associazione significativa tra gli SNP rs3817198 (LPS1) e rs13387042 (2q35) ed un aumentato rischio in soggetti portatori di mutazioni BRCA2, e, nel secondo caso BRCA1 o BRCA2. L’identificazione e studio di fattori genetici modificatori permetterà di acquisire una più approfondita conoscenza della predisposizione e patogenesi del tumore della ereditario mammella, ma anche di stimare con migliore precisione il rischio di sviluppo della neoplasia così come di fornire utili informazioni per l'identificazione di nuovi approcci terapeutici.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:MONTAGNA, MARCO
Correlatore:D'ANDREA, EMMA
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > ONCOLOGIA E ONCOLOGIA CHIRURGICA
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):Hereditary Breast Cancer, BRCA1 Unclassified Variants, Gene Identification by NMD Inhibition, Copy Number Alterations
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/06 Oncologia medica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Oncologiche e Chirurgiche
Codice ID:2880
Depositato il:29 Set 2010 11:13
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  • STRATEGIES FOR THE IDENTIFICATION OF ALLELES INVOLVED IN HEREDITARY BREAST CANCER. (deposited 29 Set 2010 11:13) [Attualmente visualizzato]

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