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Sassi, Nicola (2010) TWO TOPICS OF PHYSIOPATHOLOGICAL INTEREST IN MITOCHONDRIAL RESEARCH: INNER MEMBRANE CHANNELS AND MITOCHONDRIOTROPIC REDOX-ACTIVE COMPOUNDS. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

The group I have been part of during my doctorate thesis research is interested in various aspects of mitochondrial function. The projects I have been involved in are concerned with two very different topics; both studies have however as long-term objective the discovery and validation of compounds potentially useful for an anti-cancer action at the mitochondrial level.
The first of these projects concerns the potassium-selective channels of the inner mitochondrial membrane. A few have been discovered over the past several years. Besides participating in the regulation of mitochondrial processes and parameters these channels have attracted attention because of their involvement in other aspects of cellular physiology. Two of them seem to be able to afford protection from ischemic damage (preconditioning), while a recent study by our group in collaboration with German researchers has provided evidence that a third, mtKV1.3, plays an important role in Bax-mediated apoptosis in lymphocytes. Hence our interest in this channel.
I have verified whether mtKV1.3 might be present in the mitochondria not only of T lymphocytes, where it has been discovered, but also in those of a few other cancerous cell lines. So far I have succeeded in establishing its presence in two human lines (PC3 and MCF7) (Gulbins et al., 2010 – Chapt. 1). I have then investigated whether inhibition of the channel might cause cell death in these lines, a finding which would have been of considerable interest for the development of new chemotherapeutic drugs. Unfortunately I have not been able to obtain evidence of a death-inducing effect by a specific inhibitor of mtKV1.3 (Chapt. 2).
Within this project we have also discovered another mitochondrial channel: Ca2+-activated mtKCa3.1, which we have observed in the mitochondria of a human colon tumor line (HCT116) both by patch-clamping the inner membrane and by Wester blotting (De Marchi et al., 2009 – Chapt. 3). I have then investigated whether its inhibition might be cytotoxic or at least cytostatic, but in this case also the answer has so far been negative. I have checked for the presence of mtKCa3.1 in two other cell lines of colonic origin (C26 and Caco2) to try and understand whether this channel might be expressed in a cancer-specific manner by subsequently performing a comparison with non-tumoral cells or tissue. However, in both cases the channel has turned out to be present only in the plasma membrane (Sassi et al., 2010 – Chapt. 4).
The other project I have taken part in concerns the pharmacological exploitation of plant polyphenols, contained in many foods and beverages. A vast literature shows that these compounds have interesting biological properties which could be useful in health care endeavours such as protection from cardiovascular damage or neurodegeneration, or to prevent the onset and inhibit the growth of many types of cancer. Practical applications for these potentially useful compounds are made difficult by their low bioavailability. A priori, one way to circumvent this problem may be to cause their accumulation in an opportune site of action. The mitochondrion is an obvious choice, since polyphenols are redox-active molecules (whose activity may be anti- or pro-oxidant depending on conditions such as pH, presence of Fe2+/3+ o Cu+/2+ and concentration of the polyphenol itself) and mitochondria are the main cellular site of production of radicals as well as being mechanistically involved in cell death. Mitochondriotropic compounds might turn out to have biomedical relevance regardless of whether their activity may be anti-oxidant/cytoprotective or pro-oxidant/cytotoxic.
Our group has therefore synthesized a few derivatives of quercetin and resveratrol – two much-studied model polyphenols – capable of accumulating into mitochondria. This property is conferred by the triphenylphosphonium group (TPP), a lipophylic cation which can diffuse through biomembranes and accumulate in regions held at negative electrical potential, such as the mitochondrial matrix and the cytoplasm. We have verified that these derivatives indeed accumulate in mitochondria as expected (Mattarei et al., 2008 – Chapt. 5; Biasutto et al., 2008 – Chapt. 6). A first exploration of the biological properties of these new compounds has been carried out with two quercetin derivatives (Q3BTPI, QTA3BTPI). We have observed that these compounds supplied to isolated mitochondria are potential co-inducers of the mitochondrial permeability transition (MPT), as well as inhibitors of respiration and of the F0F1 ATPase. At the cellular level, both compounds induce an MPT-independent depolarization of mitochondria and a modest increase in the cellular production of ROS at least in the case of QTA3BTPI (Biasutto et al., 2010 – Chapt. 7).
I have extended the study to evaluate the possible cytostatic/cytotoxic action of the various mitochondriotropic compounds on tumoral (C26) and non-tumoral (MEF) cell lines. I have furthermore investigated what impact these compounds have on the mitochondria of another tumoral cell line (Jurkat lymphocytes). The results of cell vitality determinations showed that the various mitochondriotropic derivatives, administered at concentrations in the μM range, can have a cytotoxic/cytostatic activity vs. rapidly growing cells, while their effect on slowly dividing non-tumoral ones is much more modest. The initial findings of a mechanistic study have revealed that relatively high (10-5 M range) concentrations can elicit structural alterations, mitochondrial depolarization and generation of radical oxygen species (Chapt. 8).

Abstract (italiano)

Il gruppo presso cui ho svolto il mio corso di dottorato si interessa di vari aspetti della funzionalità mitocondriale. I progetti che ho seguito riguardano due ambiti molto diversi tra loro; tuttavia in entrambi i casi si tratta di studi il cui obiettivo a lungo termine è l’individuazione di composti potenzialmente utili per un’azione antitumorale a livello mitocondriale.
Uno di questi progetti riguarda i canali del potassio presenti nella membrana mitocondriale interna. Negli ultimi anni ne sono stati individuati diversi. Oltre ad aver un ruolo nella regolazione di processi e parametri mitocondriali questi canali son risultati interessanti per il loro coinvolgimento in altri aspetti della fisiologia cellulare. Due di questi sembrano aver un ruolo nella protezione dal danno ischemico (precondizionamento), mentre un recente studio svolto dal nostro gruppo in collaborazione con un gruppo tedesco ha messo in evidenza come un terzo, il mtKV1.3, svolga un ruolo importante nell’apoptosi mediata da Bax in linfociti. Da qui l’interesse da parte nostra verso quest’ultimo canale.
Ho verificato se il mtKV1.3 fosse presente nei mitocondri non solo dei linfociti T, dove è stato individuato inizialmente, ma anche in alcune altre linee tumorali. Sono riuscito finora ad individuarlo in due linee umane (PC3 e MCF7) (Gulbins et al., 2010 - Cap. 1). Ho successivamente indagato se l’inibizione del canale potesse indurre morte cellulare in tali linee. Ciò sarebbe di notevole interesse nello sviluppo di nuovi chemioterapici. Tuttavia dai risultati ottenuti l’utilizzo di inibitori specifici del canale nelle differenti linee non ha mostrato effetti rilevanti di induzione di morte cellulare (Cap. 2).
Sempre nell’ambito di questo progetto abbiamo individuato un altro canale mitocondriale: il mtKCa3.1 che abbiamo osservato nei mitocondri di una linea tumorale del colon umana (HCT116) sia mediante patch-clamp che Western blot. (De Marchi et al., 2009 - Cap. 3). Ho poi verificato se la sua inibizione potesse essere citotossica o almeno citostatica, tuttavia anche in questo caso non abbiamo ottenuto una risposta positiva. Ho verificato la presenza o meno del canale anche in due altre linee tumorali del colon (C26 e Caco2) per comprendere se fosse un canale espresso in modo tumore-specifico procedendo successivamente a confronti con cellule non tumorali, tuttavia in ambedue i casi il canale è risultato presente solo nella plasma membrana (Sassi et al., 2009 - Cap 4).
L’altro progetto da me intrapreso riguarda lo sfruttamento farmacologico dei polifenoli vegetali presenti in molti cibi e bevande. Una notevole letteratura mostra come tali composti possiedano interessanti proprietà biologiche che potrebbero esser utili in diversi ambiti, come la protezione cardiovascolare o dalla neurodegenerazione, oppure nel prevenire l’insorgere e nell’inibire la crescita di molti tipi di cancro. Questi composti dalle interessanti potenzialità trovano una notevole difficoltà d’utilizzo a causa della loro scarsa biodisponibilità. A priori, un modo per ovviare a questo problema è accumulare tali composti in un’opportuna sede d’azione. Una scelta ovvia è il mitocondrio, dato che i polifenoli sono molecole redox-attive (la cui attività può essere anti- o pro-ossidante in base a differenti condizioni come pH, presenza di Fe2+/3+ o Cu+/2+ e concentrazione del composto) e che i mitocondri son il principale sito di produzione dei radicali, oltre ad esser coinvolti nei processi di morte cellulare. Questi composti mitocondriotropici potrebbero aver una rilevanza biomedica sia che dimostrino un’attività anti-ossidante/citoprotettiva sia invece che si comportino da pro-ossidanti citotossici.
Il nostro gruppo ha quindi sintetizzato alcuni derivati di quercitina e resveratrolo - due polifenoli particolarmente studiati presi a modello - in grado di accumularsi nei mitocondri. Questo grazie alla funzionalizzazione con un gruppo trifenilfosfonio (TPP+), un catione lipofilico che può diffondere attraverso le membrane biologiche e accumularsi in regioni a potenziale negativo, quali la matrice mitocondriale e il citoplasma. Abbiamo verificato che questi derivati si accumulassero effettivamente nei mitocondri (Mattarei et al, 2008 - Cap. 5; Biasutto et al, 2008 – Cap. 6). Una prima indagine sugli effetti biologici di questi nuovi composti è stata condotta con due derivati della quercetina (Q3BTPI, QTA3BTPI). Abbiamo osservato come questi composti con mitocondri isolati siano potenziali co-induttori della transizione di permeabilità mitocondriale (MPT), nonché inibitori della respirazione e dell’ATP sintasi mitocondriale. Osservazioni a livello cellulare mostrano una depolarizzazione mitocondriale indipendente dalla MPT indotta da entrambi i composti e un modesto aumento della produzione cellulare di ROS da parte della QTA3BTPI (Biasutto et al., 2010 – Cap. 7).
Ho ampliato lo studio per valutare la possibile azione citotossica/citostatica su linee cellulari tumorali (C26) e non (MEF) dei vari composti mitocondriotropici. Ho anche indagato come tali composti influiscano sull’attività mitocondriale di un’altra linea cellulare tumorale (Jurkat). I risultati di esperimenti di vitalità cellulare mostrano come diversi composti mitocondriotropici, somministrati a concentrazioni in ambito micromolare, possano aver un’ attività citotossica/citostatica su cellule a crescita veloce, mentre il loro effetto su cellule non tumorali è molto modesto se esse hanno crescita lenta. I risultati iniziali di uno studio meccanicistico hanno evidenziato come concentrazioni relativamente elevate (nell’ambito di 10-5 M) di questi composti possano causare alterazioni morfologiche, depolarizzazione mitocondriale e generazione di specie radicaliche (Cap. 8).

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Zoratti, Mario
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > BIOSCIENZE > BIOLOGIA CELLULARE
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):mitochondria, polyphenols, potassium channels, cell death, apoptosis
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/09 Fisiologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali
Codice ID:2883
Depositato il:20 Set 2010 13:38
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