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Fogal, Stefano (2010) STUDIO DI ENZIMI D’INTERESSE MEDICO ED INDUSTRIALE. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Three main projects were carried out in the time span of my doctorate. Two of them consist in the identification of enzymes necessary to perform mid- or final steps in drugs preparation; the third is related to recombinant human tyrosinase expression, partial purification and characterization.
In collaboration with Fabbrica Italiana Sintetici (FIS), a critical step in the synthesis of a Moxifloxacin building block has been identified. An alternative enzymatic route is proposed that allows the resolution of a dicarboxylic esters racemic mixture. To this aim an enzyme that selectively hydrolyse one of the two enantiomers was searched. More precisely we aimed to use this enzyme to produce an enantiopure acid form, easy to separate from the unreacted enantiomer by organic phase extraction and used the desired enantiomer to prepare the Moxifloxacin building block (4as,7as)-ottaidro-1H-pirrolo[3,4-b]piridina. After trying several commercially available enzymes that have as substrates racemic mixtures, using different analytical approaches (NMR and HPLC-MS techniques), we succeeded in finding Candida antarctica lipase B as a highly selective enzymes that partially hydrolysed the mixture of dimethyl 1-acetylpiperidine-2,3-dicarboxylate in aqueous buffer. Enantiomer selectivity was evaluated by chiral HPLC analysis on a preparative scale, confirming that hydrolysis produces a high enantiomeric excess of the 2R, 3S form. Furthermore, MS analysis confirmed that only one of the two methyl esters was hydrolyzed by the lipase, conferring at the enzyme regioselectivity too. The reaction product was further characterized by NMR techniques (COSY, HMQC, HMBC), which indicate that hydrolysis take place on methyl group in position 3. Kinetics analysis by NMR was used to estimate the values of Km and Vmax of the hydrolysis reaction. The enzyme was used by FIS for grams-scale Moxifloxacin precursor synthesis. This process has been submitted for patent.
A second project, again in collaboration with FIS, was focus on overcoming a critical step in the organic synthesis of the hormone testosterone (TS) by a regioand stereo-specific conversion from 4-androstene-3,17-dione (AD). According to literature, no commercially available enzymes have been found that properly catalyse this transformation. Since both the substrate and the product are natural compounds, we focused the research on identification of natural enzymes that catalyze analogous reactions. The enzymatic category that catalysed this transformation is generally classified as 17b-hydroxysteroid dehydrogenases (E.C.:1.1.1.51). However these enzymes, in different organisms, differ in terms of region-selectivity and rate on catalysis. A combined bioinformatics and literature screening resulted in two candidates that were selected for recombinant expression: the 17β-hydrosteroid dehydrogenase type 5 from mouse and the YMR226c gene product of Saccaromiyces cereviseae. The coding sequence of enzymes were cloned in suitable vectors for expression, in fusion with an histidine-tag, in E.coli. Small scale preparations of the recombinant enzyme were initially set up and activity tests on the desired substrate were performed. Only the mouse enzyme showed activity towards AD and it was subjected of further studies. A small scale purifications allowed verification of the product obtained in terms of regio- and stereo-selectivity and yield, evaluation of thermal stability of the enzyme, kinetic analysis, cofactor preference (NADPH or NADH), and choice of an adequate partial organic mixture to work with, for increase substrate solubility in water. A protocol for purification of the enzyme from medium scale cultures was then designed and performed. The amount of enzyme obtained from these preparations, in combination with the commercially available D-glucose dehydrogenase required for the recycling of the cofactor NADPH, allowed the conversion of milligrams of androstendione. Also this process was submitted for patent.
The third project is on the membrane associate human tyrosinase. This enzyme is implicated in different pathologies and it is a potentially targets for drugs aimed to treat melanin synthesis disorder, melanoma and ROS associated diseases. The protein was expressed in two recombinant forms using insect cell sf9 and baculovirus system (Bac to Bac ®, Invitrogen), a system capable of glycosilation. Both forms were efficiently expressed by the cells: the wild type and a form lacking the signal sequence and the transmembrane domain. The two proteins are observed initially by western blot. The effort to define a purification protocol was focused on wild type form. It appears as a membrane associated protein and a screening with several detergents indicates that only Triton 100X, ndodecyl-β-D-maltoside and SDS were able to solubilize the protein. Following solubilisation, tests were performed in order to check its activity towards natural substrate L-DOPA and L-tyrosine, by spectrophotometeric analysis. This activity absent in not infected cells or expressing human tyrosinase in soluble form. This latter control confirmed the importance of glycosilation in correct folding of the protein. The low efficiency in the purification of protein expressed and its instability forced us to try to improve the purification protocol, cell expression and activity test. However, the low expression level of tyrosinase remained the critical point of the procedure. For this reason we decided to directly purify the protein using SDS-PAGE gel techniques. An activity test was developed using 96 well plate to determine kinetic constants of natural or artificial substrates, as well as known inhibitors. The screening was run in parallel using soluble extract of human tyrosinase and the purified tyrosinase from S. Antibioticus, an enzyme with a high level of homology with the crystallized tyrosinase from S. castaneoglobusporus. This will allow to directly compare kinetics data obtain for the two tyrosinases.

Abstract (italiano)

Tre principali progetti sono stati condotti durante il periodo di dottorato. Due di questi consistono nell’individuazione di enzimi utili a catalizzare passaggi intermedi o finali nella sintesi di principi attivi; il terzo riguarda l’espressione ricombinante della tirosinasi umana, la sua parziale purificazione e caratterizzazione.
Nel primo progetto, in collaborazione con Fabbrica italiana sintetici (FIS) è stato individuato un passaggio critico nella sintesi di un building block della Moxifloxacina e n’è stata proposto un’alternativa via enzimatica che prevede la risoluzione di una miscela racemica di un diestere precursore. A questo scopo è stato ricercato un enzima che fosse in grado di idrolizzare selettivamente uno dei due enantiomeri al fine di generare la relativa forma acida enantiomericamente pura, facilmente separabile dall’enantiomero non reagito, ed utilizzare successivamente l’enantiomero con configuraione desiderata per la preparazione del (4as,7as)-ottaidro-1H-pirrolo[3,4-b]piridina, elemento costitutivo della Moxifloxacina. Dopo aver testato diversi enzimi commerciali, già utilizzati in letturatura per effettuare risoluzioni racemiche, ed utilizzando diversi approcci analitici (tecniche NMR e HPLC-MS), è stato identificato con successo nell’enzima lipasi B di Candida Antarctica un valido strumento per idrolizzare selettivamente una miscela racemica di dimetil 1-acetilpiperidina-2,3-dicarbossilato in ambiente acquoso. La selettivià enantiomerica è stata determinata mediante HPLC chirale, confermando che l’idrolisi procede solo sull’enantiomero con configurazione 2R,3S. In più l’analisi HPLC-MS ha evidenziato che solo uno dei due gruppi metilici viene idrolizzato dalla lipasi, conferendo all’enzima anche regioselettività. Il prodotto di reazione è stato ulteriormente caratterizzanto mediante tecniche NMR (COSY, HMQC, HMBC) le quali hanno indicato che l’idrolisi avviene al metile in posizione 3. Uno studio cinetico condotto mediante NMR ha poi permesso di stimare le costanti cinetiche Km e Vmax della reazione di idrolisi. L’enzima è stato utilizzato da FIS per la sintesi in scala di alcuni grammi del precursore della Moxifloxacina. Il processo è stato sottoposto a domanda di brevetto.
Un secondo progetto, condotto ancora in collaborazione con FIS, si è focalizzato sul tentativo di superare un passaggio critico nella sintesi organica del testosterone (TS) che consiste in una riduzione regio- e stereo-specifica dal 4-andro-3,17-dione (AD). In accordo con la letteratura non esistono enzimi commercialmente disponibili in grado di catalizzare in modo appropriato questa trasformazione. Dal momento che sia il substrato che il prodotto sono composti naturali, è stata focalizzata la ricerca nell’individuazione di un enzima che in natura effettuasse l’analoga trasformazione. La categoria enzimatica che catalizza questa trasformazione è generalmente classificata come 17b-idrossisteroide deidrogenasi (E.C.:1.1.1.51). Tuttavia questi enzimi, nei diversi organismi, si differenziano in termini di regioselettività e velocità di catalisi. La combinazione di uno screening bioinformatico e bibliografico ha permesso di individuare due candidati che sono stati selezionati per l’espressione in forma ricominante: 17b-idrossisteroide deidrogenasi tipo 5 murina e il prodotto genico YMR226c di Saccaromiyces cereviseae. Le sequenze codificanti degli enzimi sono state clonate in vettori adatti per l’espressione in E.coli, anche in fusione con una coda di istidine. Una preparazione in piccola scala degli enzimi ricombinanti ha permesso di effettuare tests di attività sul substrato desiderato. Solo l’enzima murino ha mostrato attività nei confronti dell’AD ed è stato oggetto di ulteriori studi. Una preparazione in piccola scala ha permesso di analizzare il prodotto ottenuto dalla reazione, in termini di regio- e stereo-selettività e resa, così come la valutazione della stabilità termica dell’enzima, la preferenza per il cofattore (NADPH o NADH) e la scelta dell’adeguata frazione di cosolvente da utilizzare per incrementare la solubilità del substrato in acqua. Un protocollo di purificazione dell’enzima in scala più consistente è successivamente stato identificato e migliorato. La quantità di enzima ottenuta dalle preparazioni, in combinazione con l’utilizzo di una D-glucosio deidrogenasi commerciale, per riciclare il cofattore, ha permesso di convertire alcuni milligrammi di AD. Anche per questo processo è stato effettuata richiesta di brevetto.
Il terzo pregetto riguarda l’enzima tirosinasi umano. Questo enzima è implicato in diverse patologie e rappresenta un potenziale bersaglio farmaceutico per trattare disordini nella sintesi della melanina, melanoma e patologie associate a specie ROS. L’enzima è stato espresso in due forme ricombinanti utilizzando cellule di insetto sf9 e il sistema baculovirus (Bac to Bac ®, Invitrogen), un sistema in grado di effettuare la glicosilazione. Entrambi le forme, la prima nativa e la seconda priva di sequenza segnale e regione transmembrana, sono state espresse dalle cellule ed inizialmente osservate mediante analisi western blot. Il protocollo di purificazione si è focalizzato sulla forma nativa, che appare associata alle membrane. Diversi detergenti sono stati utilizzati per solubilizzare l’enima ma solo Triton 100X, n-dodecyl-β-D-maltoside and SDS si sono dimostrati efficaci. A seguto della solubilizzazione, test di attività sono stati condotti con i substrati naturali L-DOPA e L-tirosina, mediante saggi spettrofotometrici. Questa attività era assente in cellule di insetto non infettate o esprimenti la tirosinasi umana in forma solubile. Quest’ultimo controllo ha confermato l’importanza della glicosilazione nel corretto folding della proteina. Un primo protocollo di purificazione della proteina in forma nativa risultato poco efficiente ha costretto ad effettuare una serie di miglioramenti non solo nel nella purificazione, ma anche nelle condizioni di espressione e nei test di attività adottati. Tuttavia il basso livello di espressione è rimasto il punto critico della proceduta, che ha obbligato a tentare di isolare l’enzima direttamente su gel SDSPAGE. Un sistema di test di attività, sviluppato utilizzando piastre da 96 pozzetti, ha permesso di determinare le costanti cinetiche di substrati naturali ed artificiali, cosi come di inibitori noti. Lo screening è stato condotto in parallelo utilizzando l’estratto solubile contenente la tirosinasi umana e l’enzima tirosinasi di S. Antibioticus un enzima con un elevato livello di omologia con la tirosinasi di S. castaneoglobusporus la cui struttura e stata recentemente determinata. Questo ha permesso di confrontare direttamente i dati ottenuti per le due tirosinasi e proporre un modello per la tirosinasi umana.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Bergantino, Elisabetta
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > BIOCHIMICA E BIOTECNOLOGIE > BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2010
Parole chiave (italiano / inglese):tirosinasi biocatalisi enzimi
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:2885
Depositato il:20 Set 2010 10:36
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