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Tramentozzi, Elisa (2010) Analisi strutturale e funzionale di complessi tra Immunoglobuline G e "Heat Shock Proteins" isolati da plasma umano e ricostituiti "in vitro". Implicazioni fisio-patologiche nell'insorgenza di alterazioni vascolari in patologie infiammatorie ed autoimmuni. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

The research program of the Doctorate thesis dealt with experiments aimed at addressing the main questions raised by a previous research that demonstrated that in the plasma of type 1 (insulin-dependent) diabetic subjects a heat shock protein, the Glucose-regulated protein94 (Grp94) was present in complexes with IgG, also displaying characteristic structural and functional properties. Specifically, the aims of the Doctorate research were: to confirm the immunogenic role of Grp94, also testing the hypothesis that Grp94 is the shared antigen in diabetic subjects; to perform structural and functional characterization of Grp94 complexes purified from diabetic plasma in order to address the question of whether or not complexes are a biological marker of an increased risk of vascular alterations; to form in vitro complexes of native Grp94 with human non-immune IgG to be used as surrogate of native, circulating Grp94 complexes in order to investigate in depth the effects and molecular mechanisms of native complexes. The research has been performed by employing the most advanced techniques of purification and characterization of proteins from biological fluids, and methods of analysis of protein structure and measurements of biological activities on cell cultures and in vitro systems. Results confirmed the hypothesis that circulating complexes of Grp94 are an index of an increased risk of early vascular damage. This conclusion was further validated by experiments in which complexes of Grp94 formed in vitro were used which displayed on endothelial cells from human umbilical cord vein effects of cell growth stimulation and induction of angiogenic transformation overlapping those also displayed by complexes of Grp94 from diabetic plasma. Despite the marked similarity of effects, native and in vitro formed Grp94-IgG complexes also showed differences in structure and function, mostly due to different nature of IgG involved in either one type of complex. Indeed, whereas IgG forming in vivo circulating complexes with Grp94 are immune in nature – a condition that predicts the involvement of the antigen-binding site on the Fab portion – those used in vitro are non-immune, and binding of Grp94 to IgG appeared to occur at sites other than the antigen-binding site, more probably involving the hinge region of IgG.
Although biological effects displayed by complexes of Grp94, both immune and non-immune in nature, were also sustained by native Grp94 alone – a condition that pointed to Grp94 as such as entirely responsible for effects observed with any Grp94 complex, irrespective of its nature – it was nevertheless apparent that Grp94-IgG complexes have a higher capacity to activate the differentiation process with respect to Grp94 alone which instead shows a more intense proliferative activity. By investigating the time-dependent activation of both proliferation and differentiation processes by Grp94, as well as the entity of activation and underlying molecular mechanisms, it was possible to reach the conclusion that Grp94-IgG complexes, that represent the most common form in which Grp94 is detected in plasma once it is liberated extra-cellularly in pathological conditions, are actually responsible for the differentiation of cells of both innate and adaptive immunity, an effects that explains the strong capacity of Grp94 to activate the immune response in vivo.

Abstract (italian)

In questa tesi sono descritti gli esperimenti finalizzati a dare una risposta ad alcuni importanti quesiti sollevati da una precedente ricerca che aveva identificato nel plasma di soggetti diabetici di tipo 1 (insulino-dipendenti) una Heat Shock Protein (HSP) Grp94 (Glucose-regulated protein94) che circolava in complessi stabili con le IgG e presentava caratteristiche proprietà strutturali e funzionali. Gli obiettivi del progetto di ricerca riguardavano: la verifica del ruolo di immunogeno della Grp94 e la conferma della sua natura di antigene circolante comune nel diabete; la caratterizzazione strutturale e funzionale dei complessi della Grp94 plasmatica, per capire se i complessi possono rivestire il ruolo di marker biologico di danno vasale precoce; la formazione di complessi di Grp94 con IgG in vitro, da utilizzare come sostituti dei complessi trovati nel plasma a scopo investigativo, negli studi sugli effetti biologici e loro meccanismi molecolari. La ricerca ha previsto l’impiego di una serie di tecniche diverse, comprendenti quelle relative alla purificazione e caratterizzazione delle proteine da materiale biologico, analisi della struttura e misurazione di attività biologica su colture cellulari (cellule di derivazione umana) e in sistemi isolati in vitro. I risultati hanno permesso di dare una risposta esauriente ai quesiti iniziali, confermando l’ipotesi che i complessi circolanti di Grp94 con le IgG sono un indice dell’aumentato rischio di danno vasale. Soprattutto, è stato possibile avere informazioni importanti al riguardo dall’impiego dei complessi ottenuti in vitro incubando la Grp94 nativa con le IgG umane non-immuni. I complessi formati in vitro hanno evidenziato delle caratteristiche comuni con quelli circolanti nel plasma, specialmente per quanto riguarda gli effetti biologici di stimolazione della crescita cellulare ed induzione della differenziazione angiogenetica di cellule endoteliali di cordone ombelicale umano. Sono emersi comunque anche aspetti strutturali e funzionali differenti, legati alla differente natura delle IgG coinvolte nel legame alla Grp94: mentre infatti nel plasma la natura immune delle IgG stabilisce che il legame avvenga al sito di riconoscimento antigenico sui Fab, nel complesso in vitro, con le IgG non-immuni, sono coinvolti siti diversi, molto probabilmente localizzati in corrispondenza della regione hinge della molecola di IgG.
Nonostante che gli effetti biologici esplicati dai complessi di Grp94, sia immuni che non-immuni, potessero essere imputabili alla Grp94 che, allorché testata da sola produceva effetti qualitativamente simili a quelli dei complessi, i risultati hanno dimostrato che la Grp94 in complesso si differenzia per una maggior capacità di stimolare il processo di differenziazione cellulare rispetto alla Grp94 sola che invece ha rivelato una più intensa attività di stimolo sulla proliferazione. L’indagine approfondita sull’entità e la sequenza temporale di attivazione dei processi di proliferazione e differenziazione cellulare, nonché delle vie di segnale cellulare coinvolte dalla Grp94, da sola e in complessi, ha permesso di concludere che proprio i complessi di Grp94, che sono la forma in cui la Grp94 si riscontra più frequentemente nel plasma, nelle condizioni patologiche associate alla liberazione extra-cellulare di questa HSP, possono essere responsabili del processo di trasformazione delle cellule dell’immunità, sia nativa che adattiva, che rende ragione della capacità della Grp94di stimolare la risposta immunitaria.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Finotti, Paola
Ph.D. course:Ciclo 22 > Scuole per il 22simo ciclo > SCIENZE FARMACOLOGICHE > FARMACOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Data di deposito della tesi:UNSPECIFIED
Anno di Pubblicazione:15 March 2010
Key Words:Diabetes mellitus, type 1, heat shock proteins, Glucose-regulated protein94, immunoglobulins, immune complexes, angiogenic proteins, cell physiology, endothelial cells, antibody production; lymphocyte activation; Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases; cell proliferation
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/14 Farmacologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Farmacologia ed Anestesiologia "E. Meneghetti"
Codice ID:3052
Depositato il:04 Nov 2010 14:16
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