Vai ai contenuti. | Spostati sulla navigazione | Spostati sulla ricerca | Vai al menu | Contatti | Accessibilità

| Crea un account

Mastrotto, Francesca (2011) SVILUPPO DI SISTEMI NANOPARTICELLARI D'ORO PER IL DIREZIONAMENTO MULTI-MODALE AL TUMORE. [Tesi di dottorato]

Full text disponibile come:

[img]
Anteprima
Documento PDF
11Mb

Abstract (inglese)

The present research project was aimed at developing smart nano-systems able to selectively respond with morphological alterations to external physio-pathologic stimuli. These systems are intended for diagnostic or therapeutic applications in tumor treatment. The responsiveness of these systems is intended to improve the site-selective targeting efficiency and reduce uncontrolled disposition in healthy tissues.
Smart nano-systems have been obtained using gold nanoparticles (AuNPs) as platform. AuNPs have been surface coated with responsive polymeric components to endow stealth properties in physiologic conditions after injection in the bloodstream. The tumor interstitium is characterized by altered pH and temperature with respect to normal tissues. Thus, when the nano-system reaches the tumour, the responsive coating can undergo morphological modifications which modulate the interface properties of the nanoparticles. This will promote their interaction with the biological surfaces (i.e. cells, tissues).
In the project here discussed, different functionalization strategies of AuNPs have been investigated in order to develop nano-carriers provided with multimodal targeting to the tumor. Gold nanoparticles were surface decorated with targeting agents and thermosensitive or pH-sensitive polymers. This allowed producing nano-carriers in which bio-recognition can be controlled by temperature or pH. In physiological conditions, the polymer on particles surface can hide the targeting moiety while in the tumor tissue the thermosensitive or pH sensitive polymer chains collapse provoking the targeting agent exposition and thus promoting cellular internalization. As a result, the multimodal targeting will decrease aspecific biorecognition and increase site-specificity.
Gold nanoparticles were produced by Laser ablation technique in aqueous solution without addition of surfactants or stabilizing agents. This finely controlled method allows for obtaining AuNPs with a size of 18 nm.
The components used for gold nanoparticles surface functionalization have been thiolated since sulphidril groups promptly react with metal gold with high yield.
AuNPs have been surface decorated with biotin-SH and the 8 kDa thermosensitive polymer N-isopropylacrylamide-co-acrylamide-SH (pNIPAm-co-Am-SH), characterized by a low critical solution temperature (LCST) of 37 °C. The nanosystem obtained was tested by ELISA enzymatic assay to evaluate its ability to bind selectively avidin, chosen as model target, as a function of temperature. The results showed that the system behavior is thermally controlled since functionalized gold nanoparticles can only bind avidin when temperature is increased above the polymer LCST at which it collapses. Furthermore, the investigation highlighted the role of the biotin amount and of the biotin/polymer molar ratio on gold nanoparticles surface in affecting the system performance.
The system has been further investigated, according to the information acquired, with the biotinylated thermosensitive AuNPs. Gold nanoparticles were surface functionalized with folic acid-SH and the thermosensitive polymer pNIPAm-co-Am-SH to achieve temperature controlled targeting towards cancer cells overexpressing folate receptor (HiFR). Stability studies performed in PBS showed that thermosensitive polymer is paramount to avoid nanoparticles aggregation in the presence of salts. At temperature below polymer LCST, gold nanoparticles are very stable while above the LCST, only a mild aggregation was detected. Folated thermosensitive AuNPs have been tested in vitro with tumor cells overexpressing and non-expressing the folate receptor. The results showed that folated thermosensitive nanoparticles incubated with HiFR cell lines are internalized by cells and dispose in the citosol only at temperature above the polymer LCST.
The concept of multimodal targeting was extended to the development of pH-sensitive gold nanoparticles, using polymers able to respond with morphological alterations to environmental pH changes. Ideally, acid-sensitive polymers adequate for this purpose should be soluble and in coil form at pH 7.4 and convert into insoluble globular state, as a consequence of their protonation, in acidic tumor environment. To this aim, different pH-sensitive polymers were produced in order to have an array of materials with satisfactory pKa (in the physiopathological range) to chose from for gold nanoparticles functionalization. The materials were designed in order to endow acid sensitiveness to the decorated nanoparticles in the physic-pathological range. A 2-(methacryloyloxy)ethyl 3-chloro-4-hydroxybenzoate monomer (MOECHB) was chosen and pH responsive materials were obtained by living radical polymerization technique, namely reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT). One homopolymer and various random and block copolymers using the 2-(methacryloyloxy)ethyl 3-chloro-4-hydroxybenzoate and hydrophilic monomers, namelly metoxy(polyetilenglycole methacrylate (mPEGMA475) or glycerol methacrylate (GMA), were synthesized. All the polymers obtained were characterised by potentiometric titration to determine the pKa value, and turbidimetric analysis to measure the cloud point. Furthermore, their pH-dependant behavior was investigated by dynamic light scattering at various pH conditions. One random and two block copolymers, composed by MOECHB and GMA, were selected for further investigation. Decreasing pH from 7.4 to 6.5, as in physiopathologic condition, they showed a conversion from the soluble to the aggregated state. One additional block copolymer, made by MOECHB and mPEGMA475, will be also evaluated: in the same physiopathologic condition, it outlined morphological modification, albeit without aggregation. The results displayed that pH responsiveness is modulated by the 2-(methacryloyloxy)ethyl 3-chloro-4-hydroxybenzoate/hydrophilic monomer molar ratio in the polymer backbone and by the polymer molecular weight.

Abstract (italiano)

Il presente progetto di ricerca ha riguardato lo sviluppo di un nano-sistema intelligente, capace di rispondere selettivamente a stimoli esterni di tipo fisiopatologico con alterazioni morfologiche. Tali sistemi sono stati disegnati per un impiego in diagnostica o nella terapia antitumorale. La responsività di questi sistemi ha lo scopo di migliorare l’ efficienza del direzionamento selettivo e di ridurre la distribuzione aspecifica nei tessuti sani.
Sistemi intelligenti sono stati ottenuti a partire da nanoparticelle d’ oro (AuNPs), a cui sono stati associati polimeri responsivi, che conferiscono loro caratteristiche stealth in condizioni fisiologiche in seguito ad iniezione nel torrente circolatorio. E’ noto che l’ interstizio tumorale è aratterizzato da valori di pH e temperatura alterati rispetto al tessuto sano. Di conseguenza, quando il nano-sistema raggiunge il tumore, il rivestimento polimerico può² subire modifiche morfologiche che modulano le proprietà delle nanoparticelle. Questo promuoverà la loro interazione con le superfici biologiche, quali cellule e tessuti.
Nel progetto qui discusso, sono state valutate diverse strategie di funzionalizzazione di AuNPs, allo scopo di sviluppare nano-carriers caratterizzati da un direzionamento multi-modale al tumore.
Nanoparticelle d’ oro sono state derivatizzate superficialmente con agenti di direzionamento e polimeri termosensibili o pH sensibili, affinchè il riconoscimento selettivo del tessuto tumorale da parte dei nano-carriers sia controllato dalle condizioni di temperatura o di pH circostanti. In condizioni fisiologiche i polimeri presenti sulla superficie delle AuNPs schermano l’ agente di targeting, mentre nel tessuto tumorale grazie alla temperatura o pH alterati, essi collassano determinando l’ esposizione del direzionante e promuovendo l’ endocitosi cellulare. Come conseguenza, il direzionamento multi-modale diminuirà il bio-riconoscimento aspecifico a favore invece della sito-specificità.
Le nanoparticelle d’ oro utilizzate in questo progetto sono state prodotte mediante laser ablation in soluzione acquosa, senza utilizzo di sostanze surfattanti e stabilizzanti. Attraverso questo processo controllato e riproducibile si sono ottenute dispersioni di particelle diluite, con diametro medio di 18 nm.
Per la funzionalizzazione superficiale di nanoparticelle d’ oro i materiali utilizzati sono stati tiolati, nota l’ elevata capacità di coniugazione di gruppi sulfidrilici su superfici d’ oro metallico.
Il primo sistema sviluppato in questo progetto di tesi ha riguardo l’ impiego di nanoparticelle d’ oro in grado di rispondere a stimoli termici. AuNPs sono state modificate superficialmente con biotina-SH e con un polimero termosensibile di 8 kDa, N-isopropylacrylamide-co-acrylamide-SH (pNIPAm-co-Am-SH), caratterizzato da una low critical solution temperature (LCST) di 37 °C. Il sistema ottenuto è stato testato mediante saggio enzimatico di tipo ELISA per valutarne la capacità di binding selettivo ad avidina, scelta come modello, in funzione della temperatura. I risultati hanno mostrato che il comportamento del sistema è controllato dalla temperatura, in quanto le nanoparticelle sono in grado di legare l’ avidina solo quando la temperatura è superiore all’ LCST del polimero, ovvero quando il polimero stesso collassa. Lo studio ha inoltre evidenziato che la quantità assoluta di biotina e i rapporti molari biotina/polimero sulla superficie delle nanoparticelle condizionano in modo rilevante le performance del sistema
Sulla base delle ottimizzazioni realizzate con le nanoparticelle direzionate con biotina, il sistema è stato modificato superficialmente con acido folico e lo stesso polimero termosensibile (pNIPAm-co-Am-SH), allo scopo di ottenere un direzionamento verso cellule tumorali sovraesprimenti il recettore per il folato (HiFR). Gli studi di stabilità in PBS hanno mostrato come il polimero termosensibile sia indispensabile per impedire l’ aggregazione delle particelle in presenza di sali. A temperatura inferiore all’ LCST del polimero le nanoparticelle sono stabili, ed aggregano solo marginalmente a temperatura superiore. AuNPs termosensibili e funzionalizzate con acido folico sono state testate in vitro su due diverse linee celluari, sovraesprimenti e non il recettore per l’ acido folico. Gli studi hanno mostrato che solo le particelle termosensibili modificate con acido folico e incubate con linee cellulari HiFR, a temperatura superiore all’ LCST del polimero, vengono internalizzate dalle cellule e si distribuiscono nel citosol.

Il concetto di targeting multi-modale è stato successivamente ampliato per lo sviluppo di nanoparticelle d’ oro pH-sensibili, utilizzando polimeri in grado di rispondere con cambiamenti morfologici ad alterazioni del pH ambientale.
Idealmente, polimeri acido sensibili adeguati allo scopo devono essere solubili ed in conformazione estesa a pH 7.4, ma subire una conversione allo stato globulare insolubile in seguito a protonazione nell’ ambiente acido tumorale. Per raggiungere questo obiettivo sono stati sintetizzati diversi polimeri pH-sensibili, in modo tale da disporre di una gamma di materiali caratterizzati da valori di pKa e cloud point adeguati allo scopo, tra cui poter selezionare il più¹ adatto per la funzionalizzazione superficiale di nanoparticelle d’ oro. I materali sono stati disegnati per conferire alle AuNPs proprietà di acido-sensibilità nel range fisiopatologico.
E’ stato selezionato e sintetizzato un monomero acido-sensibile, 2-(metacriloilossi)etil 3-cloro-4-idrossibenzoato (MOECHB), a partire dal quale sono stati poi prodotti polimeri pH responsivi. La metodica adottata per la reazione di polimerizzazione fa parte delle cosiddette tecniche di polimerizzazioni viventi, ovvero la reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT). Sono stati sintetizzati un omopolimero e diversi copolimeri sia random che a blocchi utilizzando MOECHB e monomeri idrofilici, nello specifico metossi(polietilenglicole metacrilato) (mPEGMA475), e glicerolo metacrilato (GMA). Tutti i polimeri ottenuti sono stati caratterizzati mediante titolazione potenziometrica per determinarne il pKa, e sottoposti ad analisi turbidimetrica per misurare il punto di intorbidimento (cloud point). Il loro comportamento pH-dipendente è stato inoltre investigato mediante analisi di dynamic light scattering (DLS) effettuate a diversi valori di pH. Sono stati selezionati un copolimero random e due copolimeri a blocchi, composti da MOECHB e GMA, per ulteriori studi di funzionalizzazione di nanoparticelle d’ oro. Infatti questi materiali hanno mostrato una conversione da una forma solubile ad una aggregata insolubile per diminuzione del pH della soluzione da 7.4 a 6.5, che mima le condizioni fisiopatologiche. Un ulteriore copolimero a blocchi di MOECHB con mPEGMA475 sarà valutato, in quanto nelle medesime condizioni ha mostrato modifiche morfologiche, sebbene non si sia osservata la formazione di prodotti insolubili.
I risultati delle analisi hanno evidenziato infine che la responsività al pH è modulata dal rapporto molare 2-(metacriloilossi)etil 3-cloro-4-idrossibenzoato/monomero idrofilico nella composizione polimerica, così come dal peso molecolare del polimero.

Statistiche Download - Aggiungi a RefWorks
Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Salmaso, Stefano
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 23 > Scuole per il 23simo ciclo > SCIENZE MOLECOLARI > SCIENZE FARMACEUTICHE
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:26 Gennaio 2011
Parole chiave (italiano / inglese):gold nanoparticles, smart system, targeting multi-modale
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/09 Farmaceutico tecnologico applicativo
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Farmaceutiche
Codice ID:3473
Depositato il:29 Lug 2011 17:29
Simple Metadata
Full Metadata
EndNote Format

Download statistics

Solo per lo Staff dell Archivio: Modifica questo record