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Carbognin, Elena (2011) Belle and Aurora A are novel components of the circadian machinery in Drosophila melanogaster. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

The circadian clock is a self-sustained system that synchronizes the physiology and behaviour of most organisms with the light-dark (LD) cycles. In humans, several pathological conditions, including cancer, are related to the deregulation of the circadian clock. Drosophila melanogaster is one of the most important models for the study of the circadian mechanism. The proteins Timeless (Tim) and Period (Per) are two main components of the master clock, which is located in the brain. The synchronization of the circadian clock to environmental changes is mostly achieved by blue light-dependent degradation of Tim, via the photoreceptor Cryptochrome (Cry). Cry mediates the daily resetting of the clock by light, binding to Tim and targeting it for degradation via proteasome. The oscillator is able to keep circadian time even in the absence of external stimuli and consists of a network of genes that function in transcriptional/translational feedback loops. Among the post-translational modification that regulate clock proteins amount, localization and activity, phosphorylation is likely the most important one.
We have initiated a study in order to identify new molecular partners for Cry, both in light and dark.
1) The search for new partners of Cry by co-IP and mass spectrometry led to the identification of Belle, an ATP-dependent RNA helicase. Belle is expressed in the glial cells in fly adult brain, where also Cry is expressed. Moreover, the expression of this RNA-helicase oscillates in light-dark cycles (LD) and constant dark conditions (DD) in wild-type flies. Moreover, flies mutant for this gene do not show the typical rhythmic activity profile and show an impairment in Per expression in a subset of circadian neurons. Thereafter the downregulation of the gene causes reduced photophobicity in 3rd instar larvae and significant defects in the locomotor activity, suggesting an impairment of the circadian clock. Our data suggest that Belle is a novel “clock” protein involved in the circadian machinery of Drosophila, where it could act in the post-transcriptional control of circadian components.
2) It has been shown that the C-terminus of Cry contains putative targets for phosphorylation that play a role in the modulation of protein activity. Cry activation by light could be due to a conformational change or a release of a repressor. Phosphorylation could play an important role in the light dependent activation of the protein. In fact, AtCry1 and AtCry2 in plants (Arabidopsis thaliana) and mCry2 in mammals are phosphorylated after light exposure. in vitro experiments, performed in our lab, showed that Drosophila Cry is a putative target of the Serine-Threonine kinase Aurora A. Moreover, in silico analyses revealed that Cry C-terminus seems to contain consensus motifs which could be a target for this kinase. In particular, two Serine residues belonging to the SLIT and SNEE kinase consensus motifs in the C-terminal region result specifically phosphorylated. We have conducted a study in order to verify the in vivo role for Aurora A in Cry regulation. Analysis of single and double transgenic mutants for the residues target of phosphorylation seem to exclude a role for this sites in mediating Cry degradation after light exposure. However, experiments performed in flies over-expressing Aurora A show modifications in the circadian control of their rhythmic behaviour and display an increased degradation of Cry after light exposure. Taken together, these data suggest a putative implication of Aurora A in the regulation of Cry activity.

Abstract (italiano)

La maggior parte degli organismi viventi sincronizza le proprie attività fisiologiche e comportamentali con l’alternanza di cicli luce-buio, che si ripetono con un periodo di circa 24 ore per effetto della rotazione terrestre. Ciò è permesso grazie ad un orologio endogeno, detto circadiano (dal latino circa diem): esso rappresenta l’esempio più significativo del controllo temporale dei processi biologici. Nei mammiferi controlla l’alternanza di sonno e veglia, la secrezione di ormoni e le fluttuazioni della temperatura corporea; nelle piante la fioritura e le attività foto sintetiche; nei cianobatteri i processi di fissazione dell’azoto e del metabolismo di alcuni amminoacidi; nei funghi la regolazione dei fenomeni di sporulazione; nel moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, l’attività locomotoria e la schiusa pupale.
L’orologio circadiano è capace di percepire alterazioni di variabili ambientali e può sincronizzarsi in risposta a queste ultime, tuttavia è anche un sistema in grado di “autosostenersi” essendo attivo anche in assenza di stimoli esterni.
In Drosophila, evento fondamentale per la sincronizzazione dell’orologio in risposta alle variazioni ambientali è la degradazione in presenza di luce della proteina Timeless (Tim), questa è mediata dalla sua interazione con il fotorecettore della luce blu Cryptochrome (Cry). In seguito a fotoattivazione, Cry interagisce con Tim che viene fosforilata, ubiquitinata e degradata dal proteasoma. Successivamente, anche Cry viene degradata via proteasoma dopo esposizione alla luce ma il meccanismo che regola questo processo rimane ancora largamente sconosciuto.
Il lavoro qui presentato si divide in 2 parti, la prima è volta allo studio di un interattore molecolare di Cry e della sua caratterizzazione come componente dell’orologio circadiano, la seconda è volta all’analisi del ruolo di una chinasi nella regolazione e nella degradazione di Cry dopo esposizione alla luce.

Parte 1
Uno studio condotto nel nostro laboratorio volto alla ricerca di nuovi partner molecolari di Cry ha portato all’identificazione di Belle, una RNA elicasi ATP-dipendente. Questa proteina è espressa nelle cellule gliali del cervello di Drosophila, dove anche la proteina Cry è espressa, avvalorando l’ipotesi che vi sia un’interazione fisica tra le due. Esperimenti di Real-time PCR condotti su estratti di teste di adulti wild-type hanno evidenziato che l’espressione di questa RNA elicasi oscilla nelle 24 ore sia in alternanza di luce-buio (LD) sia in assenza di stimolo luminoso (DD). Inoltre, individui mutanti per il gene belle, mostrano un profilo locomotorio aritmico e difetti nell’espressione della proteina orologio Per in alcuni neuroni fondamentali per la generazione della ritmicità. Oltre a ciò, la caratterizzazione di linee in cui l’espressione del gene belle è ridotta ha evidenziato sia una riduzione della ritmicità circadiana negli adulti, sia un deficit a livello di risposta fotofobica dopo esposizione alla luce nelle larve terzo stadio, suggerendo che Belle sia richiesto per il normale funzionamento dell’orologio molecolare.
Nel complesso, i risultati ottenuti avvalorano l’ipotesi che la proteina Belle non sia solo un interattore del fotorecettore Cry ma anche un nuovo componente dell’orologio centrale.



Parte 2
È stato osservato che l’estremità C-terminale di Cry ha un ruolo predominante nel regolare le risposte alla luce in Drosophila. Infatti la rimozione di questo dominio sembra eliminare la necessità di luce per l’interazione con le proteine orologio Tim e Per. Mediante saggi in vitro condotti nel nostro laboratorio, è stato osservato che Cry viene fosforilata da Aurora A, una serin treonin chinasi coinvolta nel ciclo cellulare. Mediante spettrometria di massa sono stati individuati due siti di fosforilazione che corrispondono alla Serina 529, nella sequenza consenso SLIT, e della Serina 540, nella sequenza consenso SNEE, entrambi localizzati nella regione C-terminale.
Allo scopo di verificare l’effettivo ruolo della chinasi Aurora A nella regolazione dell’attività di Cry, è stata condotta un’analisi su linee linee transgeniche di Drosophila in cui i due residui sono stati mutati singolarmente o contemporaneamente. In queste linee è stata valutata la sensibilità alla luce in confronto alla linea selvatica. I risultati ottenuti non hanno evidenziato una sostanziale differenza a livello di sensibilità alla luce e ciò può essere dovuto al fatto che la variante mutata di Cry è espressa a livelli molto bassi se confrontata con la forma selvatica. Tuttavia, esperimenti condotti su linee che over-esprimono la chinasi Aurora A hanno evidenziato sia un incremento nella degradazione di Cry dopo esposizione alla luce continua, sia un deficit nella risposta circadiana a “pulse” di luce somministrati durante la notte soggettiva. Questi risultati suggeriscono che Aurora A potrebbe avere un ruolo nell’orologio circadiano ed in particolare nella regolazione dell’attività di Cry in seguito ad esposizione alla luce.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Costa, Rodolfo
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 23 > Scuole per il 23simo ciclo > BIOSCIENZE > GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE DELLO SVILUPPO
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:26 Gennaio 2011
Parole chiave (italiano / inglese):orologio circadiano, cryptochrome, Belle, Aurora A
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/18 Genetica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:3512
Depositato il:14 Lug 2011 09:49
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