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Satwekar, Abhijeet Ajit (2011) Site-specific modification of proteins by transglutaminase. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Site-specific modification of proteins by transglutaminase

Transglutaminase (TGase; EC 2.3.2.13) catalyzes the reaction between the γ-amido group of a protein-bound Gln residue (–CONH2, the acceptor) and an amino group (–NH2, the donor) of an alkyl-amine (protein-CONH2 + H2N-ligand → protein-CONH-ligand + NH3). In the case of protein substrates, TGase causes an intra- and inter-molecular crosslinking of proteins by formation of an isopeptide bond involving the side chains of Gln and Lys residues. The acyl donor can be also a small amido-ligand mimicking the Gln residue, so that TGase allows a useful and interesting variability of substrates, thus leading to the modification of proteins at the level of Gln or Lys residues using appropriate substrate reagents.
Recently, the microbial TGase from S. mobaraensis has attracted a strong interest for protein modification, considering its stability, high reactivity and small size. The X-ray structure of this TGase has been solved and shown to contain an active site given by a triad Cys-His-Asp in analogy to a protease. A striking result of recent studies is that reactions mediated by TGase can be site-specific with some proteins, sometimes leading to the modification of only one Gln residue among the many Gln residues of a protein substrate. On the other hand, there is only a moderate specificity for Lys residues. With the view to shed light into the molecular features dictating the site-specific reaction(s) of TGase, in this Thesis a number of TGase-mediated reactions have been studied using proteins of known structure and dynamics, as apomyoglobin (apoMb), egg-white lysozyme (LYS) and bovine pancreatic ribonuclease A (RNase).
Amino- as well amido-ligands have been used in the TGase-mediated reactions, so that it was possible to analyse the specificity of modification of both Gln and Lys in the examined proteins. We have found an almost strict specificity of TGase-mediated reactions at the level Gln91 of apoMb, a residue embedded in the highly flexible or unfolded helix-F of the holo protein, as given by previous NMR measurements and limited proteolysis data. Also a Gln-mimicking ligand can be covalently linket by TGase at a Lys residue of the same chain region. Thus, we concluded that local enhanced flexibility or even fully local unfolding dictates the site-specific reaction with TGase.
While RNase can be selectively modified by using an amido-ligand at the level of the ɛ-amino group of Lys1, a similar Lys1 of LYS was instead fully unreactive. It was possible to relate this finding to the flexibility and rigidity of the N-terminal region of RNase and LYS, respectively, on the basis of the crystallographically determined B-factor values (a measure of chain flexibility) of these two proteins. A nicked species of RNase with the single peptide bond Asn34-Leu35 cleaved (RNase Th1) and a LYS derivative with a single disulfide bridge reduced among the four of native LYS (LYSCM6, 127) were shown to be much more reactive in the TGase-mediated reactions than the parent intact proteins, in agreement with their enhanced flexibility or partial unfolding. Moreover, we could demonstrate that the sites or regions susceptible to TGase reactions are also prone to limited proteolysis phenomena, implying that both TGase and a protease require some local unfolding for a site-specific enzymatic reaction. Indeed, this in keeping with view that the biorecognition phenomenon is similar for both enzymes, considering also the fact that TGase acts as a reverse protease (amide synthesis instead of hydrolysis).
An interesting outcome of these studies resides in the fact that we can envisage a novel enzymatic method of covalent coupling of an amino-polymer as poly(ethylene)glycol (PEG) to specific Gln residue(s) of proteins of pharmaceutical interest. Indeed, using TGase and an amino derivative of PEG (PEG-NH2), it was possible to prepare homogeneous PEGylated derivatives of apoMb, human growth hormone (hGH) and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). Overall, we have interpreted our findings as indicating that the selective TGase-mediated reactions require a flexible or unfolded polypeptide substrate. Therefore, it is possible to predict the sites of TGase attack on a protein substrate, provided that its structure and dynamics are known. Considering the increasing relevance of PEGylated protein drugs and the high regulatory demands for their approval, it can be anticipated that the innovative methods for the site-specific PEGylation of proteins using TGase will be considered a useful advance in the methodologies used for protein modification.

Abstract (italiano)

Modifica sito-specifica di proteine con transglutaminasi

La transglutaminasi (TGasi; EC 2.3.2.13) catalizza la reazione tra il gruppo γ-ammidico di un residuo di Gln (-CONH2, accettore) ed un gruppo amminico (-NH2, donatore) di una alchil-ammina (proteina-CONH2 + H2N-ligando → proteina-CONH-ligando + NH3). Con substrati proteici la TGasi determina una reticolazione intra- e inter-molecolare di proteine mediante la formazione di un legame isopeptidico tra le catene laterali dei residui di Gln e Lys. Il donatore acilico può essere anche un ammido-ligando in grado di mimare la catena laterale di Gln e, pertanto, la TGase consente una modifica di proteine a livello dei residui di Gln o Lys utilizzando opportuni reagenti.
Recentemente, la TGase microbica da S. mobaraensis ha suscitato un notevole interesse per la modifica enzimatica di proteine, considerando la sua stabilità, elevata reattività e piccole dimensioni. La struttura ai raggi-X di questa TGase ha rivelato la presenza di un sito attivo costituito da una triade Cys-His-Asp in analogia al sito attivo di una proteasi. Recenti studi hanno dimostrato che le reazioni mediate da TGase possono essere sito-specifiche, portando talvolta alla modifica di un solo residuo Gln tra i molti residui Gln di un substrato proteico. D'altra parte, è stata accertata solo una moderata specificità per i residui di Lys. Con lo scopo di chiarire i motivi strutturali che determinano la specificità di azione della TGase, in questa Tesi sono state studiate una serie di reazioni TGase-mediate utilizzando proteine di struttura e dinamica note, come apomioglobina (apoMb), lisozima da bianco d’uovo (LYS) e ribonucleasi pancreatica bovina (RNase).
Sono stati utilizzati sia ammino- che ammido-ligandi nelle reazioni con TGase ed in tal modo è stato possibile analizzare la specificità di modifica sia a livello di Gln che di Lys con le proteine esaminate. E’ stata accertata una specificità rigorosa delle reazioni TGase-mediate a livello di Gln91 di apoMb, un residuo localizzato nel segmento corrispondente all’elica F della proteina nativa e risultato molto flessibile o unfolded in apoMb da precedenti misure NMR e da dati di proteolisi limitata. Anche un ligando in grado di mimare il residuo di Gln può essere legato da TGase a livello di una Lys incorporata nello stesso segmento flessibile. Pertanto, è stato concluso che una elevata flessibilità locale o unfolding determina la reazione sito-specifica di TGase.
Mentre con la RNase si può ottenere con TGase ed un ammido-ligando la specifica modifica a livello del gruppo ɛ-aminico di Lys1, la simile Lys1 del LYS non reagisce affatto in simili condizioni. E 'stato possibile mettere in relazione questo fatto con la flessibilità e la rigidità della regione N-terminale di RNase e LYS, rispettivamente, sulla base dei valori del fattore-B (correlato alla flessibilità della catena polipeptidica) di queste due proteine ottenuti da dati cristallografici. Un derivato di RNase con il singolo legame peptidico Asn34-Leu35 idrolizzato (RNase Th1) ed un derivato di LYS con un ponte disolfuro ridotto (LYSCM6, 127) sono risultati molto più reattivi nelle reazioni con TGase rispetto alle corrispondenti proteine native, in accordo con la loro maggiore flessibilità o parziale denaturazione. Inoltre, abbiamo potuto dimostrare che i siti o regioni suscettibili di reazioni con TGase subiscono anche fenomeni di proteolisi limitata, significando che sia la TGase che una proteasi necessitano di un local unfolding per determinare una reazione enzimatica sito-specifica. In effetti, questo è linea con il fatto che il bioriconoscimento del substrato è simile per entrambi gli enzimi, considerando il fatto che la TGase è una proteasi inversa (sintesi invece che idrolisi di una ammide).
Un risultato interessante di questi studi risiede nel fatto che si apre la strada ad un nuovo metodo enzimatico di binding covalente di poli(etilene)glicole (PEG) a livello di specifici residui di Gln in proteine di interesse farmaceutico. Infatti, utilizzando TGase ed un ammino-derivato di PEG (PEG-NH2), è stato possibile preparare derivati peghilati omogenei di apoMb, ormone della crescita umano (hGH) e granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). In generale, i risultati ottenuti hanno indicato chiaramente che le reazioni selettive di TGase richiedono un substrato flessibile o unfolded. Pertanto, è possibile prevedere i siti di attacco di TGase su un substrato proteico, se sono note la sua struttura e dinamica. Considerando la crescente importanza dei farmaci proteici peghilati e le speciali richieste di omogeneità dettate dalle autorità regolatorie, si può prevedere che la peghilazione sito-specifica con TGase di proteine di interesse farmaceutico troverà utili applicazioni.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Fontana, Angelo
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 23 > Scuole per il 23simo ciclo > BIOCHIMICA E BIOTECNOLOGIE > BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:27 Gennaio 2011
Parole chiave (italiano / inglese):Transglutaminase, PEGylation, Mass spectrometry
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/10 Biochimica
Struttura di riferimento:Centri > Centro di ricerca Interdipartimentale Biotecnologie Innovative (CRIBI)
Codice ID:3603
Depositato il:21 Lug 2011 13:10
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