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Bergamin, Giorgia (2011) Pathogenetic role of MFN2 gene: genetic analysis in patients with charcot-marie-tooth neuropathy and disease modeling in zebrafish. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Charcot-Marie-Tooth diseases (CMTs) are the most common hereditary pathologies of the peripheral nervous system. The dominant subtype CMT2A, one of the most frequent, is caused by mutations in MFN2 gene, coding for mitofusin 2, a dynamin-like GTPase located in the outer membrane of mitochondria. MFN2 is involved in several cellular processes, as the fusion of mitochondrial membranes, the transport of mitochondria along axons and the tethering of mitochondria with endoplasmic reticulum. To date more than 80 mutations associated with CMT2A and complicated variants of CMT2 have been described. They are mainly point mutations with dominant transmission, but recently some semi-dominant and recessive mutations have been reported. With the aim to identify new causing mutations and possibly identify a genotype-phenotype correlation, in the first part of this project it was performed a genetic analysis of MFN2 in 25 patients with diagnosis of axonal CMT. This analysis was conducted primarily by direct sequencing of all exons of MFN2 gene. Subsequently, in subjects where no mutations were detected, it was carried out a multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), a relatively new PCR-based technique that enables the identification of complex gene rearrangements. The genetic analysis of patients with CMT2A allowed the identification of the disease causing mutation in five probands. In four patients the mutation was found in heterozygosis, while one patient affected by an uncommonly severe axonal CMT resulted a compound heterozygote for two MFN2 mutations (p.[K38del]+[T362M]). In all, four mutations (E329del, A738V, R94P, K38del) never reported in literature were found. The analysis of MFN2 by MLPA did not revealed large gene rearrangements in patients without point mutations in MFN2, thus meaning that probably other genes are responsible for the disease in such patients and confirming the genetic heterogeneity of CMT neuropathies.
The understanding of the mechanisms by which the mutated forms of MFN2 lead to neurodegeneration is limited by the fact that few mouse models for CMT2A were successfully developed. Since zebrafish turned useful to study many neurological and neuromuscular disorders, we decided to use it to investigate the function of MFN2 and its role in CMT2A disease. Using the morpholino technique, mitofusin 2 was knocked-down in developing embryos, which resulted severely motor-impaired in accordance with the loss of limbs motility observed in CMT2A patients. Investigations performed on the neuromuscular system of morphants, demonstrated that larvae exhibit misshapened motorneurons and a reduction of neuromuscular junctions. As in human pathology, possibly because their incorrect innervation, muscular fibres appear hypotrophic and are reduced in diameter. These results, validated by the rescue of morphants with human MFN2 mRNA, confirm the essential role of mitofusin 2 in motorneurons development and suggest that the zebrafish could be a very useful tool to study in living embryos the effects of mutations identified in CMT2A patients.
Therefore, with the aim to study the mutations found in our patients, we developed a method to evaluate the effect of human mutations in MFN2 using zebrafish embryos as a model. For this reason we first concentrated on the analysis of R94Q, which is a well studied mutation found frequently in CMT2A patients with severe phenotype. By injecting the mutated human MFN2 mRNA alone and together with the morpholino against zebrafish mfn2, we demonstrated that, in the first stages of zebrafish development, R94Q is, at least in part, loss of function. This agrees with some studies performed in cells that demonstrated that this mutant allele of MFN2 cannot restore the shape of mitochondria in knock-out cells. Moreover, a previously reported R94Q knock-in mouse displayed no phenotype in heterozygous state, while in homozygosity is lethal, but survives longer than the complete knock-out, thus confirming the hypothesis that R94Q mutated mitofusin 2 has a reduced activity. However a pure loss of function mechanism was recently excluded in mouse by the finding that a transgenic model over-expressing this mutation develops movement defects and alterations in mitochondria distributions resembling CMT2A disease by the age of 5 months. Our data, together with that found in literature, suggest that R94Q, even if it has a reduced functionality, may have also a gain of function activity that is disclosed phenotypically later during development. Since our method allows the analysis of MFN2 mutations effect only during the first stages of development, we will need a stable transgenic zebrafish model to confirm the mechanism of action of R94Q and analyse the effect of MFN2 mutations found in the patients we investigated.
Altogether the results obtained with this work contributed to clarify the possible genotype-phenotype relations involved in CMT2A disease. Moreover it was proposed zebrafish as a new tool to dissect the molecular mechanism by which mitofusin 2 mutations lead to CMT2. Being easily amenable to drug screening, the zebrafish model could be not only a useful complement to the studies performed in mouse, but it may also contribute to identification of effective pharmacological compounds for the treatment of Charcot-Marie-Tooth disease.

Abstract (italiano)

Le Charcot-Marie-Tooth (CMT) sono le più comuni patologie ereditarie del sistema nervoso periferico. Il sottotipo CMT2A, uno dei più frequenti, è causato da mutazioni nel gene MFN2, codificante mitofusina 2, una proteina GTPasica, per struttura simile alla dinamina, localizzata a livello della membrana esterna dei mitocondri. MFN2 risulta implicata in diversi processi cellulari, quali la fusione della membrana mitocondriale esterna dei mitocondri, il trasporto di questi lungo gli assoni e il tethering tra mitocondri e reticolo endoplasmatico. Ad oggi sono state identificate più di 80 mutazioni associate alla CMT2A e a varianti complicate di CMT2. Tali mutazioni sono nella maggior parte dei casi mutazioni puntiformi a trasmissione autosomica dominante, ma recentemente sono state identificate anche alcune mutazioni a trasmissione semi-dominante o recessiva. Con lo scopo di identificare nuove mutazioni in mitofusina 2 e individuare una possibile correlazione genotipo-fenotipo, nella prima parte di questo progetto si è proceduto a condurre un’analisi genetica del gene in 25 pazienti con diagnosi di CMT assonale. Tale analisi è stata condotta primariamente mediante sequenziamento diretto degli esoni di cui il gene MFN2 è composto. Successivamente, nei soggetti risultati negativi all’analisi per sequenziamento, si è proceduto ad eseguire un’analisi mediante la tecnica della multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), la quale consente di identificare eventuali riarrangiamenti genici, non identificabili mediante sequenziamento. L’analisi genetica dei pazienti ha permesso di identificare la mutazione causativa in cinque probandi. In quattro di questi sono state trovate mutazioni in eterozigosi, mentre un paziente affetto da una grave forma di CMT assonale è risultato essere un eterozigote composto per due mutazioni in MFN2 (p.[K38del]+[T362M]). Delle mutazioni così rilevate, quattro (E329del, A738V, R94P, K38del) non risultavano prima descritte. La frequenza delle mutazioni di MFN2 nel campione indagato (20%) è in accordo con i dati di letteratura. L’analisi di MFN2 mediante MLPA non ha invece permesso di rilevare alcun riarrangiamento genico.
Attualmente lo studio dei meccanismi tramite cui mutazioni in MFN2 inducono neurodegenerazione è limitato dal fatto che solo pochi modelli di CMT2A sono stati sviluppati con successo in topo. Considerando che lo zebrafish si è recentemente distinto come un buon modello per lo studio di molte malattie neurodegenerative, si è deciso di investigare la funzione di mitofusina 2 e il suo ruolo nella patogenesi della CMT2A in tale organismo. Mitofusina 2 è stata quindi silenziata durante lo sviluppo di zebrafish usando un oligo-morfolino antisenso, il quale viene direttamente iniettato in uova fecondate. L’analisi del fenotipo dei morfanti ha permesso di evidenziare come, in assenza di mfn2, gli embrioni presentino evidenti alterazioni fenotipiche ed in particolare risultino avere gravi problemi di movimento, in accordo col fenotipo osservato nei pazienti. Ulteriori analisi hanno evidenziato che il sistema neuromuscolare delle larve è gravemente compromesso, con motoneuroni morfologicamente alterati e una riduzione del numero di giunzioni neuromuscolari correttamente formate. Inoltre, come nei pazienti, le fibre muscolari risultano ipotrofiche e con diametro ridotto, probabilmente a seguito della denervazione dei muscoli dei somiti. Tali risultati, validati da esperimenti di rescue con il trascritto umano di MFN2, confermano il ruolo fondamentale di mitofusina 2 nello sviluppo dei motoneuroni e suggeriscono che lo zebrafish può essere uno strumento utile per lo studio in vivo degli effetti delle mutazioni trovate nei pazienti con CMT2.
Per tale motivo si è proceduto a mettere a punto un metodo che consentisse di valutare l’effetto delle mutazioni in MFN2 utilizzando lo zebrafish come modello. Ci si è concentrati in primo luogo sull’analisi della mutazione R94Q, la più frequentemente identificata nei pazienti e per la quale sono disponibili svariate informazioni riguardanti il suo meccanismo molecolare, ottenute sia da indagini in vitro che in vivo. Mediante esperimenti di iniezione dell’mRNA umano mutato, sia in presenza che in assenza del morfolino contro mfn2, si è potuto dimostrare che nei primi stadi dello sviluppo di zebrafish, R94Q è, almeno in parte, loss of function. Tale risultato è in accordo con alcuni dati ottenuti da studi in vitro che dimostrano che tale allele mutato di MFN2 non è in grado di ripristinare la forma del network mitocondriale in cellule derivate da topi knock-out per Mfn2. Inoltre una linea di topi knock-in per R94Q non mostra alcun segno patologico quando la mutazione è in eterozigosi, mentre è letale, ma tardivamente rispetto al knock-out, in omozigosi. Tuttavia un solo meccanismo di loss of function non è in grado di spiegare il fatto che una linea transgenica di topi in cui R94Q è sovraespressa nel sistema nervoso mostri un fenotipo compatibile con la CMT2A a partire dai 5 mesi di vita. I dati così ottenuti, confrontati con quelli di letteratura, suggeriscono che R94Q, pur avendo funzionalità ridotta, potrebbe avere anche un effetto di gain of function, il quale però è in grado di manifestarsi solo dopo lo sviluppo embrionale. Va segnalato che il metodo messo a punto, permette di evidenziare alterazioni solo nei primi stadi dello sviluppo e per tale motivo sarà necessario sviluppare delle linee transgeniche stabili di zebrafish per confermare il meccanismo d’azione di R94Q. Questo potrà permettere di ampliare l’indagine anche valutando gli effetti delle mutazioni in MFN2 rilevate con la presente indagine.
Nel complesso i dati ottenuti con questo lavoro hanno contribuito a chiarire la possibile correlazione genotipo-fenotipo in pazienti affetti da CMT2A. Inoltre è stato possibile identificare zebrafish come un nuovo strumento per l’analisi del meccanismo d’azione di mutazioni in MFN2 associate a CMT2. Dato che zebrafish è un organismo modello che si presta meglio di altri a esperimenti di drug screening, la validazione di un sistema modello per la CMT2A in zebrafish potrebbe in futuro contribuire all’identificazione di nuovi farmaci efficaci per il trattamento di tale patologia.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Mostacciuolo, Maria Luisa
Correlatore:Vettori, Andrea
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 23 > Scuole per il 23simo ciclo > BIOSCIENZE > GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE DELLO SVILUPPO
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:31 Gennaio 2011
Parole chiave (italiano / inglese):Charcot-Marie-Tooth mitofusin 2 mfn2 zebrafish mitochondria
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/13 Biologia applicata
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:3805
Depositato il:13 Lug 2011 10:58
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