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De Poli, Matteo (2011) Synthesis and use of rigid peptide scaffolds. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

To understand in detail very complex natural systems with different inter- and intramolecular interactions or to create nanosystems with interestingly new properties like molecular recognition and information storage, it is often necessary to design model compounds of reduced complexity with well defined geometry. In this Ph.D. thesis it was decided to apply the properties of Cα-tetrasubstituted α-amino acids to fold into particularly stable 310-helical structures for the design of rigid templates and foldamers to be utilized in different spectroscopic and 3D-structural studies as well as in organic syntheses.

1. New spectroscopic techniques and helical peptides

A) 2D IR. We have combined two-dimensional infrared (2D IR) spectroscopy and isotope substitutions to reveal the vibrational couplings between a pair of amide-I and amide-II modes that are several residues away but directly connected through a hydrogen bond in a helical peptide. This strategy is demonstrated on a 310-helical hexapeptide and its 13C, 18O and 15N labelled isotopomers in CDCl3. The isotope-dependent amide-I/II cross peaks clearly show that the second and fourth peptide linkages are vibrationally coupled as they are in proximity, forming a 310-helical turn. This study reveals that the combination of 2D IR and isotope labelling is a useful approach to achieve structural information with residue-level specificity (in collaboration with the group of prof. N.-H. Ge, University of California, Irvine).
B) VCD. Coupling between the amide linkages in a peptide or protein is the key physical property that gives vibrational spectra and circular dichroism sensitivity to secondary structures. By use of rational 13C isotopic labelling, the amide I band for selected residues was effectively isolated in the synthesized hexa- and octapeptides having dominant 310-helical conformations. The frequency and intensity responses were measured with IR absorption, vibrational circular dichroism, and Raman spectroscopies and simulated with DFT-based computations. Band fitting the spectral components was used to determine coupling constants. The sequential amide coupling for 310- helices is weaker than for α-helices, but larger than poly-(Pro)n type-II helices (in collaboration with the group of prof. T.A. Keiderling, University of Illinois, Chicago)

2. Cα-Methyl proline: a unique example of split personality

Cα-Methyl-L-proline is one of the most conformationally constrained α-amino acid. In this work, we examined the tendency of a number of Nα-acyl dipeptide N'-alkylamides of the type RCO-(αMe)Pro-Xxx-NHR' or RCO-Xxx-(αMe)Pro-NHR', in which Xxx is L (or D)-Ala, Aib, or L (or D)-(αMe)Pro, long enough to fold into intramolecularly hydrogen-bonded γ- or β- turns. The results are compared with those obtained for the corresponding dipeptides based on Pro, a well-known turn-forming residue. We used FT-IR absorption, 1H and 13C NMR spectroscopies and X-ray diffraction for a detailed conformational analysis. We conclude that (αMe)Pro is able to explore both trans' and cis' ψ areas of the conformational space, but in (αMe)Pro the latter is overwhelmingly more populated, in marked contrast to the Pro preference. This finding is a clear indication that in (αMe)Pro the major 3D-structural determinant is the Cα-methyl group. The electronic circular dichroism signature of a peptide type-III' β-turn conformation is also proposed.

3. Macrocyclizations on helical peptides

By taking advantage of the research period spent in the groups of prof. R.H. Grubbs and prof. D.J. O’Leary (California Institute of Technology, Pasadena, and Pomona College, Claremont, California, respectively), we used the olefin metathesis reaction to build up the first 310-helical bis-peptide bundle (ladder peptide). In this chapter we report the synthesis and preliminary conformational characterizations of this large peptide macrocycle rich in Aib. In order to obtain an α-amino acid to be used as a linker in the preparation of the ladder peptide, we first evaluated the possibility of incorporating an allyl moiety into an α-amino acid side-chain without loss of optical activity. After having tried different approaches, Asp appeared to be best choice. The synthesis of the ladder peptide was accomplished via solution-phase methods and the RCM-derived macrocycle was subjected to conformational analysis with FT-IR absorption, NMR and ECD spectroscopies. Preliminary results suggest this cyclic peptide to be largely 310-helical, confirming the high propension of Aib-containing peptides to form ordered secondary structures. Two major confomers were detected by NMR in DMSO solution. A model involving a tilting motion between helices was tentatively proposed to account for this result, though further analyses are needed to confirm such hypothesis.

Abstract (italiano)

Per comprendere in dettaglio sistemi naturali molto complicati, con diverse relazioni inter- ed intramolecolari, oppure per creare nuovi nanosistemi con proprietà quali il riconoscimento molecolare o la conservazione di informazioni è necessario poter progettare e sintetizzare molecole modello di complessità ridotta nonchè una struttura tridimensionale ben definita. In questa Tesi di Dottorato è stato deciso di applicare la capacità degli α-amminoacidi CPαP-tetrasostituiti di formare strutture 3B10B-elicoidali particolarmente stabili, al fine di disporre di peptidi rigidi utili per studi di tipo spettroscopico, conformazionale e per applicazioni in sintesi organica.

1. Nuovi tipi di spettroscopie e sistemi peptidici rigidi

A) 2D IR. La spettroscopia di assorbimento infrarosso a due dimensioni (2D IR), insieme alla marcatura isotopica hanno permesso di rivelare gli accoppiamenti vibrazionali esistenti tra i modi ammide-I e ammide-II di residui distanti tra loro ma direttamente connessi attraverso un legame a idrogeno. Questa strategia è stata dimostrata su un peptide elicoidale di tipo 310 ed i suoi isotopomeri marcati con 13C, 18O e 15N. Grazie ai picchi fuori diagonale, riconoscibili dalla marcatura isotopica, si è dimostrato che i modi ammide I e II del secondo e quarto legame peptidico sono accoppiati vibrazionalmente, in quanto formano un ripiegamento elicoidale stabile di tipo 310. Con questo studio si è messo in evidenza che il 2D IR unito ad una opportuna marcatura isotopica può essere un metodo utile per ottenere informazioni strutturali già a livello di singolo residuo (in collaborazione con il gruppo della prof.ssa N.-H. Ge, University of California, Irvine).

B) VCD. Gli accoppiamenti che si instaurano tra legami ammidici sono alla base della capacità della spettroscopia di assorbimento FT-IR o del dicroismo circolare elettronico di distinguere tra varie strutture secondarie di peptidi o proteine. Grazie all’uso della marcatura sito-specifica mediante 13C, si è potuto isolare la banda dell’ammide I in spettri di esa- ed ottapeptidi aventi conformazione elicoidale di tipo 310. Frequenza ed intensità di tali assorbimenti sono state misurate attraverso spettroscopia Raman, assorbimento FT-IR e VCD e successivamente simulate con calcoli DFT. Le costanti di accoppiamento sono state ottenute grazie al fitting dei componenti delle bande spettrali. L’accoppiamento sequenziale ottenuto per eliche di tipo 310 è più debole di quello nelle α-eliche, ma maggiore di quello ottenuto per la poli-(Pro)n di tipo II (in collaborazione con il gruppo del prof. T.A. Keiderling, University of Illinois, Chicago).

2. Cα-metilprolina: un particolare caso di doppia personalità

La Cα-metilprolina è uno degli α-ammino acidi conformazionalmente più ingombrati. In questo lavoro si sono esaminate le preferenze conformazionali di un vasto numero di Nα-acil dipeptidi N'-alchilammidi del tipo RCO-(αMe)Pro-Xxx-NHR' o RCO-Xxx-(αMe)Pro-NHR' (con Xxx = L (o D)-Ala, Aib, oppure L (o D)-(αMe)Pro) sufficentemente lunghi per dare ripiegamenti di tipo γ o β stabilizzati da legami a idrogeno intramolecolari. I risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli dei corrispondenti dipeptidi basati sulla Pro, residuo che notoriamente tende a dare tali ripiegamenti. Mediante le spettroscopie di assorbimento FT-IR, 1H e 13C NMR nonchè la diffrazione ai raggi X è stata condotta un’analisi strutturale dettagliata, grazie alla quale si desume che l’(αMe)Pro è in grado di esplorare entrambe le zone trans' e cis' dello spazio conformazionale. Tuttavia, quest’ultima zona è considerevolmente più popolata nel caso dell’(αMe)Pro, in netto contrasto con quanto accade per la Pro. Questo fatto è una indicazione piuttosto chiara del fatto che nell’(αMe)Pro è il metile sul Cα a dirigere le preferenze conformazionali di questo α-ammino acido. In base a tali risultati è stato proposto l’andamento caratteristico dello spettro ECD per un ripiegamento β di tipo III'.

3. Macrociclizzazioni su eliche peptidiche

In seguito al periodo trascorso in qualità di visiting student presso il gruppo di ricerca dei proff. R.H. Grubbs e D.J. O’Leary (California Institute of Technology e Pomona College, rispettivamente) si è voluto esplorare l’uso della reazione di metatesi olefinica nella costruzione del primo fascio bis-peptidico 310-elicoidale (ladder peptide). In questo capitolo viene riportata la sintesi ed alcune prime indagini conformazionali di questo macrociclo peptidico ricco di residui di Aib. Nella prima parte del lavoro si è valutata la possibilità di inserire un’unità allilica in catena laterale di un α-ammino acido senza problemi di racemizzazione. Dopo vari tentativi, è stato scelto Asp come α-ammino acido avente funzione di linker nella preparazione del fascio peptidico. La sintesi del ladder è proseguita con metodi in soluzione e il macrociclo ottenuto attraverso RCM è stato sottoposto a una prima analisi conformazionale in soluzione mediante assorbimento FT-IR, spettroscopia NMR e ECD. I risultati sinora ottenuti indicano che questo peptide tende ad assumere una conformazione elicoidale di tipo 310 in soluzione, confermando quanto atteso per sequenze peptidiche ricche di Aib. Dall’analisi NMR, inoltre, si evince la presenza di un equilibrio tra due conformeri maggioritari in soluzione di DMSO. Nonostante siano necessari ulteriori dati per confermare tale ipotesi, si è tentato di spiegare tale effetto mediante l’instaurarsi di una rotazione reciproca tra le due eliche peptidiche.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Toniolo, Claudio
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 23 > Scuole per il 23simo ciclo > SCIENZE MOLECOLARI > SCIENZE CHIMICHE
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:31 Gennaio 2011
Parole chiave (italiano / inglese):synthesis - peptides - Aib - 2D IR - VCD - X-ray - NMR - RCM
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/06 Chimica organica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chimiche
Codice ID:3809
Depositato il:19 Lug 2011 17:21
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