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Fabbri, Giulia (2011) Genome-based technologies provide novel insights into the pathogenesis and the clinical response of lymphoid malignancies. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

After obtaining the M.D. Degree from the University of Padua with a thesis entitled “Evaluation of Minimal Residual Disease in ALL relapsed patients”, I started in the same University the Ph.D. School in Developmental Medicine and Programming Sciences, Immunology and Onco-haematology, under the supervision of Professor Giuseppe Basso. Since then, the research projects in which I was directly involved were all focused in hematology-oncology related topics.

During the first two years of Ph.D. training I applied molecular biology technologies to monitor the clinical course of patients affected by acute lymphoblastic leukemia (ALL), which is the most frequent pediatric hematologic malignancy. In particular, I was involved in research projects aimed at evaluating the prognostic value of Minimal Residual Disease (MRD) analysis in pediatric ALL patients.
Despite the major advances in ALL treatment achieved in the last decades, recurrence of this disease remains the leading cause of treatment failure, occurring in 20% of patients. The early response to therapy is the most important prognostic factor in ALL. Around 95% of ALL patients achieve the Complete Remission (CR), which is judged by the absence of morphologically identifiable leukemic blasts in bone marrow smears. However, such finding can correspond to a still substantial burden of leukemic cells, and indeed many patients, despite achieving the CR, subsequently relapse. The persistence of leukemic cells not detectable by common cyto-morphological techniques is defined Minimal Residual Disease.
Combined MRD status at the end of induction treatment and at the beginning of therapy consolidation is recognized as the most important prognostic factor, and it is now routinely implemented in stratifying ALL patients in different classes of risk. This stratification is expected to contribute to improve the overall outcome of children affected by ALL. Among the different alternative methods available for MRD monitoring, the detection of immune gene (Ig/TCR) rearrangements by real-time quantitative PCR (RQ-PCR) is the most widely used as it is feasible in the vast majority of the patients.
In a study performed in Professor Basso’s Lab, described in Chapter 1.1, we analyzed the role of MRD after reinduction therapy on the outcome of 60 ‘high-risk’ relapsed ALL patients (those with an early BM recurrence or with T-ALL marrow relapse), enrolled in the AIEOP LAL REC 2003 study protocol. We performed MRD monitoring based on the detection of Ig/TCR rearrangements by RQ-PCR at different time-points during therapy: i) time point 1 (TP1), after induction; ii) time point 2 (TP2), after re-induction, and iii) time point 3 (TP3), after consolidation. The overall 3-year event-free survival for patients with MRD levels at the TP1 ≥10-4 was significantly lower (19%), as compared to patients with MRD levels negative or below 10-4 (73 and 45%, respectively). The statistical significance of MRD predictive prognostic value was confirmed by multivariate analysis. This study demonstrated that early MRD evaluation in ‘high-risk’ ALL relapses allows the identification of a subset of patients who seem not to benefit from conventional treatment, including chemotherapy and hematopoietic stem cell transplantation, and who could therefore need alternative, novel, experimental therapies.
Medullary ALL relapse is currently still defined employing morphologic criteria, i.e. presence of a blast percentage exceeding 25% in a bone marrow sample after complete remission. To date there are only a few studies suggesting that it is possible to predict impending morphologic relapse through MRD monitoring in hematologic malignancies. In another study performed in Professor Basso’s Lab (described in Chapter 1.2) we evaluated the clinical significance of MRD monitoring in ALL pediatric patients as an indicator of impending hematological disease recurrence. Towards this aim we monitored MRD during and after treatment in 113 patients enrolled in the AIEOP-BFM ALL 2000 clinical trial and we performed a case-control study of 37 relapsed ALL children matched with 37 ALL controls in continuous complete remission. The cumulative incidence of relapse in patients with positive quantifiable results was significantly higher (85.7%) than that of children with MRD results either negative or positive below the quantitative range. Relapse of ALL could have been predicted by MRD monitoring in 82% of patients who were evaluated within 3 months before relapse occurrence. This study suggested that detection of positive and quantifiable MRD during follow-up is highly predictive of subsequent hematologic relapse of pediatric ALL. Accuracy of such a prediction would improve by performing monitoring every 3 months. In addition, it could be helpful to design and administer personalized salvage therapy before overt hematologic relapse, namely when the tumor burden is lower. Additional clinical studies are needed to prove whether therapeutic intervention based on MRD results can improve the final outcome of pediatric ALL patients

After finishing the first two years of my Ph.D. program, I wanted to get more involved in basic research, aimed at understanding the pathogenetic mechanisms of hematologic malignancies. I therefore continued my training in Professor Riccardo Dalla-Favera’s Laboratory (Columbia University, New York), under the supervision of Professor Laura Pasqualucci, whose main focus is the study of the pathogenesis of B-cell derived lymphomas. Cancer is associated with the accumulation of various genetic alterations, whose spectrum can provide important insights in understanding its pathogenesis and rational bases for innovative targeted therapeutic strategies. We applied novel genome-wide technologies including next generation whole-exome sequencing and genome-wide high-density single nucleotide polymorphism (SNP) array analysis to an extended panel of B cell malignancies, including diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) and chronic lymphocytic leukemia (CLL), in order to determine their full spectrum of genetic lesions. The ultimate goal of these projects is to identify novel target genes involved in the pathogenesis of these diseases, assess their physiological role in normal B cell development and their pathological role in lymphomagenesis.
The whole exome sequencing analysis of 7 DLBCL cases integrated with SNP array analysis of 72 DLBCL cases led to the identification of >450 loci affected by somatic point mutations and/or by recurrent, focal gene copy number (CN) aberrations. Among those that have been so far independently validated, we found frequent genomic deletions and/or somatic mutations inactivating the genes that encode CREBBP and, in a smaller fraction of cases, EP300, two highly related histone and non-histone acetyltranferases (HAT) that act as transcriptional coactivators in multiple signaling pathways (overall frequency ~39%). The analysis of these genes in various types of mature B-Non-Hodgkin lymphomas, including Follicular lymphoma (FL), Burkitt Lymphoma (BL), Marginal-Zone Lymphoma (MZL) and Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL), revealed the presence of genomic lesions affecting these genes also in ~41% of FL cases. The vast majority of the identified lesions were removing or inactivating the HAT coding domain of these two genes. Interestingly, CREBBP and EP300 lesions were commonly affecting one allele, suggesting that reduction in HAT dosage is important for lymphomagenesis. By studying the functional consequences of these lesions, we demonstrated specific defects in acetylation-mediated inactivation of the BCL6 onco-protein and activation of the p53 tumor-suppressor. These results identified CREBBP/EP300 mutations as a major pathogenetic mechanism shared by common forms of B-NHL, and have direct implications for the use of drugs targeting acetylation/deacetylation mechanisms. The results of this study are described in Chapter 2.1.
The whole exome sequencing analysis of 5 CLL cases revealed a total of 38 somatic non-silent mutations, corresponding to 38 distinct genes at an average of 7.6 mutations/case (range, 5-10/case). The somatically mutated genes were belonging to a variety of functional classes, including chromatin remodeling genes, members of pathways such as NF-κB, TGF-β and Wnt, and genes involved in cytoskeleton organization and cell motion. The majority of the identified events were represented by single base-pair substitutions (N=36, of which 32 missense mutations and 4 nonsense mutations), while frameshift insertions/deletions were rare (N=2 deletions of 4 and 32 base pairs, respectively). Analysis of the mutation features showed a prevalence of transitions versus transversions (69% vs 31%) and an elevated G+C over A+T ratio (69% vs 31%), analogous to the mutation spectrum observed in the genome of epithelial tumors such as colorectal, pancreatic and brain cancer.
The SNP array analysis of the same five cases used for the whole exome sequencing analysis identified a relatively low number of gene CN aberrations (N=14), corresponding to an average of 2.8 lesions/case (range, 0-5/case), mostly represented by deletions (N=11/14, 80%).
The genes newly identified through the whole exome sequencing approach were tested for recurrence by PCR amplification and direct sequencing of their entire coding region and by SNP array analysis in an independent panel of 48 CLL cases. This analysis revealed that the majority of these genes were not recurrently altered in CLL, while 5 genes showed either recurrent mutations or CN aberrations at a relatively low frequency (≤ 6% of CLL cases).
Overall, our integrated approach revealed that the coding genome of CLL appears to be relatively stable, harboring on average 10 potentially relevant genetic alterations per case. The low frequency of alterations in individual genes may reflect a high recurrence of lesions affecting commom pathways important for the pathogenesis of the disease. The results of this study are described in Chapter 2.2.

Abstract (italian)

Dopo aver conseguito la Laurea in Medicina e Chirurgia presso l'Università degli Studi di Padova con una tesi dal titolo "Valutatione della Malattia Residua Minima in pazienti LAL ricaduti", ho iniziato, presso lo stesso Ateneo, la Scuola di Dottorato in Medicina dello Sviluppo e Scienze della Programmazione con indirizzo in Emato-oncologia sotto la supervisione del Professor Giuseppe Basso. Nel corso della Scuola di Dottorato ho partecipato a progetti di ricerca focalizzati sullo studio di malattie emato-oncologiche.

Nel corso dei primi due anni di Dottorato mi sono avvalsa di tecniche di biologia molecolare per monitorare il decorso clinico di pazienti affetti da leucemia acuta linfoblastica (LAL), la più frequente neoplasia ematologica dell'età pediatrica. In particolare, mi sono occupata di studi mirati alla valutazione del valore prognostico del monitoraggio della Malattia Residua Minima (MRM) in pazienti pediatrici LAL.
Nonostante i notevoli progressi compiuti nelle ultime decadi nel trattamento della LAL pediatrica, la recidiva di malattia, che colpisce il 20% dei pazienti circa, resta la causa più frequente di fallimento terapeutico. La risposta precoce alla terapia è il fattore prognostico più importante nella LAL. Il 95% dei pazienti raggiunge la remissione completa (RC), che è definita secondo criteri morfologici come assenza di blasti leucemici nell'aspirato midollare. Tale reperto può tuttavia corrispondere ad una massa tumorale ancora considerevole. Pertanto molti pazienti, nonostante raggiungano la remissione completa, vanno incontro a recidiva. La persistenza di cellule leucemiche non identificabili con le comuni tecniche citomorfologiche è definita Malattia Residua Minima (MRM). Lo status della MRM al termine della terapia di induzione e all’inizio del consolidamento è considerato il fattore prognostico più importante nella LAL pediatrica, tanto da essere diventato un parametro usato routinariamente per stratificare i pazienti LAL in diverse classi di rischio che vengono trattate con distinti regimi terapeutici.
La Real-Time quantitative PCR (RQ-PCR) per i riarrangiamenti genici dei recettori degli antigeni (Ig/TCR) è il metodo attualmente più usato per il monitoraggio della MRM essendo applicabile nella grande maggioranza dei pazienti.

In uno studio condotto nel Laboratorio del Professor Basso, e descritto nel Capitolo 1.1, abbiamo analizzato il ruolo della MRM post-terapia di reinduzione sulla prognosi di 60 pazienti LAL ricaduti ad alto rischio, affetti da recidiva midollare precoce o ad immunofenotipo T, in accordo con i criteri del protocollo terapeutico AIEOP REC 2003. Abbiamo monitorato la MRM mediante uso di RQ-PCR per i riarrangiamenti genici Ig/TCR in diverse fasi della terapia: i) dopo l'induzione (TP1); ii) dopo la reinduzione (TP2) e iii) dopo il consolidamento post-ricaduta (TP3).
L'Event Free Survival (EFS) a tre anni dalla ricaduta è risultata significativamente inferiore in pazienti con MRM con valori ≥10-4 al TP1 (19%), rispetto a pazienti con MRM negativa o con valori <10-4 (73 e 45%). Il valore prognostico predittivo della MRM è risultato essere statisticamente significativo anche mediante analisi multivariata.
I risultati di questo studio dimostrano che una valutazione precoce del valore della MRM in pazienti LAL recidivati ad alto rischio permette di identicarne il subset che sembra non beneficiare dei regimi terapeutici convenzionali, quali la chemioterapia ed il trapianto allogeneico, e che potrebbe necessitare di innovative terapie sperimentali.
La ricaduta midollare di LAL è attualmente definita secondo criteri morfologici come conta di blasti ≥25% in un prelievo midollare successivo a quello della remissione completa. Ad oggi è stato pubblicato un numero relativamente basso di studi che suggeriscono la possibilità di prevedere la ricaduta morfologica di LAL mediante monitoraggio della MRM in neoplasie ematologiche.
In uno studio svoltosi presso il Laboratorio del Professor Basso, descritto nel Capitolo 1.2, abbiamo valutato il significato del monitoraggio MRM come indicatore di successiva ricorrenza ematologica di LAL. A questo scopo abbiamo monitorato i livelli di MRM nel corso e dopo il termine della terapia in 113 pazienti arruolati nel protocollo terapeutico AIEOP-BFM LAL 2000 ed abbiamo condotto uno studio caso-controllo su 37 pazienti LAL ricaduti e 37 pazienti LAL in RC continua. L'incidenza cumulativa di ricaduta in pazienti con riscontro di uno o più prelievi con MRM positiva quantificabile nel corso del follow-up è risultata significativamente più elevata (86%) rispetto ai casi con MRM negativa o al di sotto del quantitative range della tecnica. Inoltre, in pazienti monitorati per MRM entro 3 mesi dalla ricaduta, la ricorrenza di malattia sarebbe risultata prevedibile nell'82% dei casi. Questo studio ha dimostrato che il riscontro di un prelievo positivo per MRM nel corso del follow-up è altamente predittivo di successiva ricaduta ematologica in pazienti pediatrici LAL. L'accuratezza di tale predizione sembra essere più elevata in caso di monitoraggio ogni 3 mesi. Inoltre, questi dati suggeriscono che una somministrazione precoce della terapia di recupero prima del manifestarsi della ricaduta ematologica, in presenza di una massa tumorale più limitata, potrebbe migliorare la risposta al trattamento ed il decorso clinico dei pazienti. Ulteriori studi clinici saranno necessari per dimostrare in maniera conclusiva se un intervento terapeutico basato sulla MRM può migliorare la prognosi dei pazienti pediatrici LAL.

Al termine dei primi due anni di Dottorato ho deciso di dedicarmi in prima persona non solo a progetti di ricerca clinici, ma anche a progetti di ricerca di base, con lo scopo di capire e studiare i meccanismi fisiopatologici delle neoplasie ematologiche. Ho quindi continuato la mia formazione presso il Laboratorio del Professor Riccardo Dalla Favera, sotto la supervisione della Professoressa Laura Pasqualucci, il cui principale campo di interesse è lo studio della patogenesi dei linfomi a cellule B. Il cancro è una patologia associata con il progressivo accumulo di alterazioni genetiche, il cui spettro è molto importante non solo per comprenderne la patogenesi, ma anche per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate. Abbiamo usato tecnologie genome-wide quali il next-generation whole exome sequencing e la analisi di SNP array in un pannello di neoplasie ematologiche costitutito da linfomi diffusi a grandi cellule (DLBCL) e da leucemie linfatiche croniche (CLL). Lo scopo di questi progetti è l'identificazione di nuovi geni coinvolti nella patogenesi di queste malattie, lo studio del loro ruolo fisiologico nello sviluppo dei linfociti B e patologico nella linfomagenesi.
Il sequenziamento dell'esoma di 7 casi di DLBCL integrato con l'analisi di SNP Array di 72 casi di DLBCL ha portato all'identificazione di più di 450 loci colpiti da mutazioni somatiche e/o da aberrazioni del copy number (CNAs) focali e ricorrenti. Tra i geni validati fino ad ora, abbiamo trovato frequenti delezioni e/o mutazioni somatiche inattivanti i geni che codificano per CREBBP e, in una percentuale più bassa di casi, EP300 (frequenza totale, 39% dei DLBCL). CREBBP e EP300 sono due acetil-transferasi istoniche e non altamente correlate, che agiscono come coattivatori trascrizionali in numerose cascate di trasduzione del segnale. L’analisi di questi geni in altri tipi di linfomi a cellule B ha portato all’identificazione di lesioni genetiche a carico di CREBBP e EP300 anche nel 41% dei casi di linfoma follicolare (FL). La grande maggioranza di queste lesioni provoca la rimozione o l’inattivazione dell’HAT domain di questi due enzimi. Inoltre, le alterazioni di CREBBP e EP300 colpiscono frequentemente un singolo allele, suggerendo che la riduzione dell’HAT dosage ha un ruolo importante nella patogenesi dei DLBCL e dei FL. Lo studio funzionale delle consequenze di queste lesioni ha dimostrato l’evidenza di difetti nell’inattivazione dell’onco-proteina BCL6 e nell’attivazione dell’onco-soppressore p53 mediate da acetilazione.
Questi dati hanno dunque dimostrato il ruolo patogenetico di lesioni geniche a carico di EP300/CREBBP in due comuni tipi di linfoma a cellule B. Inoltre i risultati di questo studio hanno un'implicazione clinica diretta, suggerendo il possibile utilizzo di farmaci operanti su meccanismi di acetilazione e deacetilazione nella terapia dei linfomi. I risultati di questo lavoro sono descritti nel Capitolo 2.1.
Il sequenziamento dell’esoma di 5 casi di CLL ha rivelato 38 mutazioni somatiche a carico di 38 distinti geni, con una media di 7.6 mutazioni per caso (range, 5-10/caso). I geni mutati appartengono a diverse classi funzionali, essendo coinvolti in processi di rimodellamento cromatinico, in pathways quali NF-κB, TGF-β e Wnt, e in meccanismi di organizzazione del citoscheletro e di motilità cellulare.
La maggioranza delle mutazioni somatiche identificate è risultata essere costituita da sostituzioni di una singola base (N=36, di cui 32 mutazioni missenso e 4 nonsenso), mentre una minoranza da inserzioni/delezioni causanti alterazioni del frame (N=2 delezioni di 4 e 32 basi, rispettivamente). L’analisi dello spettro delle mutazioni puntiformi ha mostrato una prevalenza di transizioni (69% degli eventi) e un’elevata ratio G+C/A+T (69%/31%). Tale pattern è risultato essere analogo allo spettro di mutazioni riportato nell’esoma di neoplasie epiteliali, tra cui tumori a carico del colon e del pancreas, e tumori del sistema nervoso centrale, tra cui neuroblastomi e medulloblastomi.
L’analisi di SNP array degli stessi casi usati per il sequenziamento dell’esoma ha rivelato un numero relativamente basso di CNAs (N=14), corrispondente ad una media di 2.8 lesioni per caso (range, 0-5 CNAs/caso), rappresentate soprattuto da delezioni (N=11/14, 80%).
L'analisi dei nuovi geni identificati tramite il sequenziamento dell'esoma in un pannello indipendente di 48 casi di CLL ha rivelato che la maggioranza di questi geni non è alterata in modo ricorrente nella CLL. In 5 geni sono state riscontrate mutazioni e/o CNAs con una frequenza relativamente bassa (≤ 6% dei casi).
In conclusione, questi dati dimostrano che il genoma codificante della CLL contiene in media 10 alterazioni geniche per caso. Lo screening di questi geni per mutazioni e CNAs in un pannello esteso di casi ha rivelato che i geni identificati tramite questo approccio sono alterati a bassa frequenza nella CLL. Tale bassa frequenza di alterazioni a carico del singolo gene può suggerire la presenza di alterazioni ricorrenti a carico di altri geni coinvolti in pathways comuni che potrebbero avere un ruolo importante nella patogenesi della CLL. I risultati di questo studio sono descritti nel Capitolo 2.2.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Basso, Giuseppe
Data di deposito della tesi:UNSPECIFIED
Anno di Pubblicazione:30 January 2011
Key Words:genome-based technologies lymphoid malignancies
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/38 Pediatria generale e specialistica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Pediatria
Codice ID:3839
Depositato il:20 Jul 2011 10:01
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