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Musetti, Caterina (2011) SELECTIVE TARGETING OF NUCLEIC ACIDS BY SMALL MOLECULES: A DNA STRUCTURE RECOGNITION APPROACH. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

The discovery of new anticancer targets is the key factor for the development of more efficacious therapies. Sequence selective binding of double stranded DNA in the classical B form has been extensively employed to target small molecules to defined polynucleotide portions. More recently, ligand recognition of non canonical DNA foldings has been additionally considered a useful approach to selectively target distinct genomic regions. In this connection, G-quadruplexes represent an interesting system since they are believed to be physiologically significant arrangements. These non-canonical DNA structures are found at the ends of the human chromosomes (telomeres) as well as at promoter regions of several oncogenes where there is a cluster of guanine-rich sequences and they are likely to play important roles in the regulation of biological events. The induction and stabilization of the G-quadruplex arrangement by small molecules can lead to the inhibition of the telomerase activity by interfering with the interaction of the enzyme and its single stranded template. A similar molecular mechanism is likely involved in the transcriptional control that leads to the suppression of the oncogene transcription and, ultimately, in the regulation of the gene expression. As a result, the quadruplex topic is very attractive for the development of a specific anticancer strategy defined by a dramatic reduction of side effects, typical of chemotherapy.
The purpose of this work is to investigate the interactions between novel classes of small molecules and different quadruplex DNA sequences and conformations. These new molecules were properly designed providing systematic atom-wise substitutions based on rational evaluations of previous studied compounds in order to increase their selectivity for G-quadruplex structures and to reduce toxic effects. Biophysical and biological properties of all new derivatives are herein evaluated at molecular and cellular level.
The thesis work is divided into three main sections based on the structural features of the compounds object of study. The first part focuses on heterocyclic dications: upon changing their molecular binding shape, a correlation with G-quadruplex binding have been drawn. In particular it was possible to rationalize a shift in the binding modes, in particular between end stacking and groove recognition. Nevertheless a correlation between biophysical (G-quadruplex affinity) and biological (telomerase inhibition and cytotoxicity) results was not always clear. This feature may suggest the involvement of cellular targets different from the telomere and that are now under investigation.
In Chapter 3, the DNA binding properties of some phenantroline derivatives in presence and in absence of Ni(II) and Cu(II) are investigated. We confirmed that different complex geometries involving one, two or three ligands per metal ion can affect the pattern of DNA recognition by driving nucleic acid conformational changes.
Finally, in Chapter 4 some transplatin derivatives are evaluated. We focused our attention on defining the compounds capability to form adducts, with the nucleic acids, the nature of adducts and the kinetics of adduct formation not only on double strand DNA but also using single strand as well as G-quadruplex as targets. The results showed how different structural modifications can cooperate to greatly affect the potential interaction of the compounds. Interestingly it turned out their preference to react on single stranded DNA portions than to double stranded ones. This is probably due to an unfavourable orientation of the reactive groups when the molecule interacts with the DNA substrate. As a result, they appear to crosslink unpaired strands. By extending these results at cellular level they can reflect distinct distribution of platination site along the genome in comparison to cisplatin and even transplatin.
The results obtained increment the available knowledge of DNA-small molecules interaction. In particular it emerged that a conserved interaction mode is consistent with biological effects. On the other hand, a shift in the binding mode can drive to different cytotoxic effects. This can provide a rationale for subsequent drug structure optimization leading to the development of new efficient and selective anticancer agents.

Abstract (italiano)

La scoperta di nuovi target anticancro è il fattore chiave per lo sviluppo di terapie sempre più efficaci. Lo studio del legame selettivo a sequenze di DNA a doppia elica nella classica forma B è stato largamente impiegato al fine di direzionare piccole molecole verso porzioni polinucleotidiche definite. Più recentemente, il riconoscimento (da parte di ligandi) di porzioni non canoniche di DNA si può tradurre in un metodo vantaggioso per indirizzare questi composti verso regioni distinte del genoma. A tale proposito, le strutture G-quadruplex rappresentano un sistema interessante poiché sono ritenute fisiologicamente significative.
Queste strutture “non-canoniche” di DNA si trovano alle estremità del cromosoma (telomeri) così come in varie regioni promotrici di oncogeni in cui vi è un’abbondante presenza di residui guaninici e sembrano coinvolte nella regolazione di importanti eventi biologici. Pare infatti che l'induzione e la stabilizzazione di strutture G-quadruplex dalle parte di piccole molecole porti all'inibizione dell'attività della telomerasi interferendo con l'interazione tra l’enzima e il suo substrato a singola catena. Un simile meccanismo molecolare è probabilmente coinvolto anche nel controllo della regolazione dell'espressione genica e può portare alla soppressione della trascrizione di un oncogene. Di conseguenza, “l’approccio G-quadruplex” si rivela molto interessante per lo sviluppo di una strategia anticancro specifica caratterizzata anche da una riduzione drammatica degli effetti collaterali, tipici della chemioterapia.
Lo scopo di questo lavoro è lo studio delle interazioni tra nuove famiglie di piccole molecole e diverse conformazioni di DNA G-quadruplex. Queste nuove molecole sono state opportunamente progettate apportando sostituzioni di atomi o gruppi funzionali basate sulla valutazione di composti precedentemente studiati al fine di aumentare la loro selettività per strutture G-quadruplex e di ridurre gli effetti tossici. Le proprietà biofisiche e biologiche di tutti i nuovi derivati sono state valutate al livello molecolare e cellulare.
Il lavoro di tesi si divide in tre parti in base alle caratteristiche strutturali dei composti. La prima parte è dedicata alla studio di dicationi eterociclici: si è cercato correlare modifiche nella conformazione molecolare con l’affinita’ verso strutture G-quadruplex. In particolare è stato possibile razionalizzare cambiamenti della modalità di legame in base alla struttura dei composti esaminati. Tuttavia una correlazione fra i risultati biofisici (affinità G-quadruplex) e biologici (inibizione della telomerasi e citotossicità) non è risultata sempre definita. Ciò può suggerire il coinvolgimento di bersagli cellulari diversi dal telomero umano.
Nel capitolo 3, sono state studiate le proprietà di legame al DNA di alcuni derivati fenantrolinici in presenza ed in assenza di Ni (II) e Cu (II). Abbiamo confermato che complessi caratterizzati da diverse geometrie che coinvolgono una, due o tre molecole per ione possono compromettere o meno il riconoscimento del DNA o determinare cambiamenti conformazionali dell'acido nucleico. Per concludere, il capitolo 4 è dedicato allo studio di derivati del transplatino. In particolare ci siamo focalizzati nel definire la capacità dei composti di formare addotti, la natura dei complessi e la cinetica di formazione del complesso non solo con DNA a doppio filamento ma utilizzando anche substrati a singola catena come il G-quadruplex. I risultati hanno dimostrato come diverse modifiche strutturali possano avere un ruolo importante nell’interazione dei composti con gli acidi nucleici. E’ risultata interessante la loro preferenzialità a reagire con porzioni di DNA a singolo filamento rispetto a sequenze a doppia elica. Ciò è probabilmente dovuto ad uno sfavorevole orientamento dei gruppi reattivi quando la molecola interagisce con il substrato di DNA. Di conseguenza, i composti sembrano formare un cross-link tra due filamenti non appaiati. A livello cellulare, questi risultati riflettono una distinta distribuzione del sito di platinazione all’interno del genoma rispetto al cisplatino e perfino rispetto al transplatino.
I risultati ottenuti incrementano la conoscenza disponibile sull’interazione tra DNA e piccole molecole. In particolare è emerso che la conservazione della modalità di interazione si correla con effetti biologici definiti. Al contrario, una variazione della modalità di legame può portare a effetti citotossici differenti. Ciò può fornire una spiegazione razionale per una successiva ottimizzazione della struttura dei composti finalizzata allo sviluppo di nuovi agenti antitumorali efficaci e selettivi.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Palu', Giorgio
Correlatore:Sissi, Claudia
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 23 > Scuole per il 23simo ciclo > BIOMEDICINA
Data di deposito della tesi:NON SPECIFICATO
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2011
Parole chiave (italiano / inglese):DNA; G-quadruplex; small molecules; anticancer; telomeres; metal complexes; transplatinum planar amines; heterocyclic diamidines
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Farmaceutiche
Codice ID:3840
Depositato il:01 Ago 2011 09:08
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