Studio dell'Espressione della Protimosina-Alfa nelle Cellule Germinali Meiotiche e Post-Meiotiche Durante La Prima Ondata Spermatogenetica di Ratto e Negli Spermatozoi Epididimali

Prothymosin-α (PTMA) is a small, highly acidic protein, first studied in the rat thymus as an immunogenic factor (Haritos et al., 1984a), and soon detected in a wide variety of mammalian tissues, including heart, brain, kidney and gonads (Haritos et al., 1984b; Clinton et al., 1989). The protein is noticeably conserved through evolution: it has been found in all the Mammals studied so far and, only recently, in a restricted number of non-mammalian Vertebrates, such as Rana esculenta, (Aniello et al., 2002), Danio rerio (Donizetti et al., 2008) and Torpedo marmorata (Prisco et al., 2009). PTMA uncommon structural features support the adoption of a native random-coil conformation (Gast et al., 1995), which favours both its interaction with several cationic species and its varied localization, that spans from nuclear and cytoplasmic intracellular environments to the extracellular districts (Enkermann et al., 2000b, Mosoian, 2011), allowing for its established participation in a substantial variety of physiological processes. Among the multiple functions that have been associated with PTMA are cell proliferation, DNA packaging (through its binding to histone H1), activation of transcription, cell survival, and neoplastic transformation, some of which have often been ascribed to molecular mimicry. Only few studies have tried to weigh its possible involvement in reproduction, specifically in male gametogenesis: the first reports suggested that PTMA might be associated with the proliferative and early-meiotic phases of Mammal spermatogenesis (Rosón et al., 1990). Some years later our group started a comparative project on vertebrate spermatogenesis and reported, for the first time, the isolation of the prothymosin in a non-mammalian species, the Amphibian Rana esculenta (Aniello et al., 2002): ptma transcript is highly expressed through the annual reproductive cycle of this frog, peaking in September/October, when meiosis is active and the first phases of spermiogenesis are occurring, and it is localized in I and II spermatocytes (SPC), as well as in the interstitial Leydig cells (LC; Aniello et al., 2002). Consistently, the protein has been found in the germinal compartment, from IISPC to spermatozoa (SPZ), and in the LC (Ferrara et al., 2009). A congruent pattern has been recently highlighted in studies on the fish Torpedo marmorata. Thus, our data have suggested that PTMA could be associated with the meiotic and post-meiotic phases of vertebrate spermatogenesis. In order to extend our comparison and to evaluate the possible conservation of this pattern in Mammals, in the present work we have studied the correlation between PTMA and the meiotic and post-meiotic phases of rat spermatogenesis. After confirming the presence of both the transcript and its protein in the testes of adult specimens, we focused on the first wave of spermatogenesis, analysing young male gonads sampled at three developmental time points, each one suitable for the thorough observation of specific germ cell (GC) types: 27 dpp (days post-partum), when meiosis has been completed for the first time; 35 dpp, during the spermiogenic phase; 60 dpp, after the end of the first wave, when the testis is fully developed. Our experiments showed that the expression levels of both Ptma mRNA and of the corresponding protein decrease in total extracts from 27 to 60 dpp. The in situ hybridization localized the transcript in interstitial LC, peritubular myoid cells (PMC) and, inside the tubules, in GC from pachytene SPC to the newly formed haploid SPT. The immunohistochemistry analysis localized the protein in the same cell types at 27 dpp, while in the germinal compartment at 35 and 60 dpp PTMA is only detectable in the haploid cells. Further analysis have shown that the protein is associated with the acrosome system throughout its biogenesis, up until its final perinuclear destination in the head of SPZ (Ferrara et al., 2010), as corroborated by immunofluorescence studies on rat and human mature gametes. Thus, our data reveal, for the first time, that PTMA may play a direct role in the maturation of Mammal SPZ, or even be involved in the subsequent events of fertilization.

La protimosina-α (PTMA) è una proteina acida di piccole dimensioni, studiata per la prima volta nel timo di ratto quale fattore immunogeno (Haritos et al., 1984a), e in seguito identificata in molteplici tessuti dei Mammiferi, tra cui il cervello, il cuore, i reni, e le gonadi (Haritos et al., 1984b; Clinton et al., 1989). La proteina è filogeneticamente conservata: la sua presenza è stata confermata in ogni Mammifero finora studiato, mentre, solo di recente, è stata scoperta in un ristretto numero di Vertebrati non mammiferi, quali Rana esculenta, (Aniello et al., 2002), Danio rerio (Donizetti et al., 2008) e Torpedo marmorata (Prisco et al., 2009). Le atipiche caratteristiche strutturali di PTMA favoriscono l’assunzione di una conformazione nativa random-coil (Gast et al., 1995), che le consente di interagire con numerose molecole di natura cationica. Ciò, insieme alla sua localizzazione, che si estende dal nucleo al citoplasma fino ai distretti extracellulari (Enkermann et al., 2000b, Mosoian, 2011), giustifica la sua partecipazione in una elevata varietà di processi biologici. Tra le innumerevoli funzioni associate a PTMA vi sono la proliferazione cellulare, il rimodellamento della cromatina (tramite il legame all’istone H1), l’attivazione trascrizionale, la difesa dai sistemi di morte cellulare, e la trasformazione neoplastica, ruoli che sono stati spesso spiegati con l’ipotesi del mimetismo molecolare. Pochi studi finora hanno affrontato il possibile coinvolgimento di PTMA nella riproduzione, precisamente nella gametogenesi maschile: i primi riscontri hanno suggerito che la proteina possa essere associata alle fasi proliferative e alle prime fasi meiotiche della spermatogenesi dei Mammiferi (Rosón et al., 1990). In seguito, il nostro gruppo ha dato inizio a un progetto di tipo comparativo sulla spermatogenesi dei vertebrati e ha riportato, per la prima volta, l’isolamento della protimosina in una specie non-mammifera, l’Anfibio Rana esculenta (Aniello et al., 2002): il trascritto di ptma è espresso ad alti livelli durante il ciclo riproduttivo annuale della rana, con un picco in Settembre/Ottobre, quando sono in corso le meiosi e le prime fasi della spermiogenesi, ed è localizzato negli spermatociti III (SPC) I e II, e nelle cellule di Leydig (LC; Aniello et al., 2002). Analogamente, la proteina è stata rilevata nel compartimento germinale, dagli SPCII agli spermatozoi (SPZ) e nelle LC (Ferrara et al., 2009). Recentemente, è stato evidenziato un pattern corrispondente nel pesce selaceo Torpedo marmorata. I nostri dati suggeriscono, dunque, che PTMA sia associata alle fasi meiotiche e post-meiotiche della spermatogenesi dei vertebrati. Allo scopo di proseguire gli studi comparati e di valutare la possibile conservazione del pattern nei mammiferi, nel presente testo abbiamo studiato la correlazione tra PTMA e le fasi meiotiche e post-meiotiche della spermatogenesi di ratto. Per prima cosa abbiamo confermato la presenza del messaggero e della proteina nei testicoli di esemplari adulti, poi ci siamo soffermati sulla prima ondata della spermatogenesi, analizzando gonadi di giovani ratti prelevate a tre tempi di sviluppo, ognuno valido per l’osservazione approfondita di specifiche cellule germinali (CG): 27 giorni dopo la nascita (dpp), momento in cui le meiosi sono state completate per la prima volta; 35 dpp, durante la spermiogenesi; 60 al termine della prima ondata, quando il testicolo è ormai maturo. I nostri dati mostrano che sia i livelli di espressione dell’mRNA di Ptma, sia della proteina subiscono una riduzione da 27 a 60 dpp. L’ibridazione in situ ha permesso di localizzare il trascritto nelle LC e nelle cellule peritubulari mioidi (PMC) e, nei tubuli, dagli SPC in pachitene agli SPT aploidi di nuova formazione. L’analisi di immunoistochimica ha mostrato che la proteina si trova negli stessi tipi cellulari a 27 dpp, mentre nel compartimento germinale a 35 e a 60 dpp è rilevabile solo nelle cellule aploidi (Ferrara et al., 2010). Ulteriori indagini hanno mostrato che PTMA è associata al sistema acrosomale durante tutto il processo di biogenesi, fino alla sua destinazione perinucleare nella testa dello SPZ, come supportato da studi di immunofluorescenza su gameti maturi di ratto e uomo. Pertanto, i nostri dati rivelano, per la prima volta, che PTMA potrebbe avere un ruolo diretto nella maturazione degli SPZ dei Mammiferi, o addirittura concorrere alla realizzazione degli eventi successivi della fecondazione.