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Rampazzo, Elena (2012) Analysis of the molecular and phenotypic effects mediated by brain tumour microenvironment on glioblastoma derived cells through in vitro and in vivo models. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Glioblastoma multiforme (GBM) is one of most common and still poorly treated
primary brain tumors. One of the biggest challenges in brain tumour research is the
possibility of reprogramming cancer cells toward less aggressive phenotypes. To reach
this aim however, a more complete understanding of the biology of GBM cells is
needed, in particular considering the role played by hypoxia as a signaling pathways
regulator. In search for new therapeutic approaches, Bone Morphogenetic Proteins
(BMPs) have been demonstrated to induce astroglial commitment in GBM-derived cells
in vitro. The mTOR pathway represent a controversial link between the pro-stemness
hypoxic pathway and the pro-differentiating BMPs pathway. Indeed, HIF-1α is
controlled at the transcriptional and translational level by mTOR and, alike BMP, also
mTOR pathway modulates glial differentiation in central nervous system (CNS) stem
cells. Here, we investigate the role of mTOR signaling in the regulation of HIF-1α
stability in primary GBM-derived cells maintained under hypoxia (2% oxygen). We
found that GBM cells, when acutely exposed to high oxygen tension, undergo
Akt/mTOR pathway activation and that BMP2 acts in an analogous way. Importantly,
repression of Akt/mTOR signaling is maintained by HIF-1α through REDD1
upregulation. On the other hand, BMP2 counter-acts HIF-1α stability by modulating
intracellular succinate and by controlling proline hydroxylase 2 (PHD2) protein through
inhibition of FKBP38, a PHD2 protein regulator. Despite being encouraging, these data
suggested that hypoxia, which is characteristic of the brain niche where GBM reside,
strongly counter-acts BMP effects; so a new therapeutic approaches able to counteract
tumour growth also in its hypoxic microenvironment is fundamental. In the second part
of this study, we reprogrammed primary GBM-derived cells toward a less oncogenic
phenotype by activating Wnt pathway in GBM hypoxic microenvironment, that usually
correlates with a malignant behaviour of cancer cells. We demonstrate that exogenous
Wnt3a ligand mediates neuronal differentiation and proliferation inhibition of GBM
cells and that this phenomenon is enhanced under hypoxic conditions by HIF-1α-
mediated up-regulation of β-catenin co-factors TCF1 and LEF1. Moreover, we show
that Wnt pathway activation inhibits Notch signalling, thus enhancing the prodifferentiating
effects exerted by the Wnt activated pro-neuronal genes NEUROD1 and
4
NEUROG1, and that this occurs mainly in the GBM cancer stem cell subpopulation
(CD133+). By using a zebrafish-based protocol for orthotopic xeno-transplantation of
primary GBM-derived cells, we show that Wnt pathway activation is able to promote
neuronal differentiation of GBM cells by inhibiting Notch signalling also in an in vivo
setting.
Conclusions: In this study we elucidate the molecular mechanisms by which two prodifferentiating
stimuli, BMP2 and acute high oxygen exposure, control HIF-1α stability.
We previously reported that both these stimuli, by inducing astroglial differentiation,
affect GBM cells growth. We also found differences in high oxygen and BMP2
sensitivity between GBM cells and normal cells that should be further investigated to
better define tumor cell biology. Moreover, we add more information in the epistatic
relationship between HIF-1α, Wnt and Notch signalling in GBM-derived cells,
demonstrating a Wnt-regulated suppression of Notch activity in the hypoxic
microenvironment of GBM tumours.
The third part of my PhD study focused on Medulloblastoma (MDB) which is the most
common brain malignancy of childhood. It is currently thought that MDB arises from
aberrantly functioning stem cells in the cerebellum that fail to maintain proper control
of self-renewal. Additionally, it has been reported that MDB cells display higher
endogenous Notch signalling activation, known to promote the survival and
proliferation of neoplastic neural stem cells and to inhibit their differentiation. While
interaction between Hypoxia Inducible Factor-1α (HIF-1α) and Notch signalling is
required to maintain normal neural precursors in an undifferentiated state, an interaction
has not been identified in MDB. Here, we investigate whether hypoxia, through HIF-1α
stabilization, modulates Notch1 signalling in primary MDB-derived cells. Our results
indicate that MDB-derived precursor cells require hypoxic conditions for in vitro
expansion, whereas acute exposure to 20% oxygen induces tumor cell differentiation
and death through inhibition of Notch signaling. Importantly, stimulating Notch1
activation with its ligand Dll4 under hypoxic conditions leads to expansion of MDBderived
CD133+ and nestin+ precursors, suggesting a regulatory effect on stem cells. In
contrast, MDB cells undergo neuronal differentiation when treated with γ-secretase
inhibitor, which prevents Notch activation.
5
Conclusions. These results suggest that hypoxia, by maintaining Notch1 in its active
form, preserves MDB stem cell viability and expansion.
Significance: We add new insights in the regulation of brain tumour stem cells and
contribute to clarify the complex relationship between diverse signalling pathways in
controlling GBM cell phenotype.

Abstract (italian)

Il Gliobalstoma multiforme (GBM) è il più comune dei tumori cerebrali nell’adulto, con
una prognosi ancora oggi particolarmente infausta e senza trattamenti efficaci. Una
delle grosse sfide da affrontare nella ricerca sui tumori cerebrali è la possibilità di
riprogrammare queste cellule verso un fenotipo meno aggressivo. Per raggiungere
questo scopo tuttavia è necessaria una più ampia e completa conoscenza della biologia
di questo tumore, in particolare del ruolo dell’ipossia come regolatore delle principali
pathways coinvolte nel modulare il fenotipo delle cellule di GBM. Nella ricerca di
nuovi approcci terapeutici, le Bone Morphogenetics proteins (BMPs) si sono dimostrate
efficaci nell’indurre un differenziamento astrogliale delle cellule di GBM in vitro. Il
pathway di mTOR rappresenta un collegamento controverso fra il mantenimento della
staminalità, mediato dall’ipossia, e il differenziamento mediato dal BMP pathway.
Infatti l’Hypoxia Inducible Factor-1α (HIF-1α) è controllato a livello trascrizionale e
traduzionale dalla proteina mTOR e, come il BMP, lo stesso mTOR pathway modula il
differenziamento gliale delle staminali neurali nel sistema nervoso centrale. In questo
studio abbiamo valutato il ruolo del pathway di mTOR nel regolare la stabilità di HIF-
1α in cellule primarie derivate da GBM e mantenute in ipossia (2% O2). Abbiamo
dimostrato che, quando esposte ad alte tensioni di ossigeno (20% O2), le cellule di GBM
attivano il pathway di Akt/mTOR e che la somministrazione del BMP2 promuove
effetti analoghi. In particolare, abbiamo dimostrato che HIF-1α reprime il pathway di
Akt/mTOR attraverso la up-regolazione della proteina Redd1, inibitore di mTOR. In
maniera opposta, BMP2 contrasta la stabilità di HIF-1α modulando I livelli
intracellulari di succinato e controllando i livelli di proline hydroxylase 2 (PHD2),
6
attraverso l’inibizione di FKBP38, una proteina regolatoria della PHD2. nonostante
siano incoraggianti, questi dati suggeriscono che l’ipossia, caratteristica della nicchia
dei tumori cerebrali, contrasta fortemente gli effetti del BMP2; quindi un approccio
terapeutico in grado di arrestare la crescita tumorale anche nel suo microambiente
ipossico è fondamentale. Nella seconda parte dello studio, l’intento è stato quello di
riprogrammare cellule primarie derivate da GBM verso un fenotipo più differenziato e
meno aggressivo attivando il Wnt pathway nel loro microambiente ipossico, solitamente
correlato con la malignità delle cellule tumorali. Abbiamo dimostrato che la
somministrazione esogena del ligando Wnt3a media il differenziamento neuronale e
l’inibizione della proliferazione nelle cellule di GBM e che questo fenomeno è più forte
in condizioni ipossiche grazie ad una up-regolazione dei co-fattori della β-catenina
TCF1 and LEF1. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’attivazione del Wnt pathway
inibisce il segnale intracellulare di Notch, incrementando gli effetti pro-differenziativi
del Wnt che attiva per-se i geni pro-neuronali NEUROD1 e NEUROG1. In particolare,
questi effetti si esplicano nella sottopopolazione cellulare tumorale staminale
(CD133+). Per valutare gli effetti dell’attivazione di questa pathway in vivo abbiamo
messo a punto un protocollo di xeno-trapianto ortotopico di cellule primarie derivate da
GBM in larve di Zebrafish (Danio Rerio). Le evidenze ci dimostrano che l’attivazione
del Wnt pathway è in grado di promuovere il differenziamento neuronale delle cellule di
GBM e di inibire il Notch pathway anche nel contesto di un modello animale.
Conclusione: in questo studio abbiamo delucidato i meccanismi molecolari attraverso
cui due stimoli pro-differenziativi, BMP2 e osiigeno, controllino la stabilità di HIF-1α.
Abbiamo riportato in precedenti lavori che entrambi questi stimoli inducono il
differenziamento astro gliale e bloccano la crescita delle cellule di GBM. Abbiamo
inoltre evidenziato le differenze tra cellule tumorali di GBM e cellule staminali neurali
sane nella risposta agli stimoli pro-differenziativi, divergenze di risposta che richiedono
ulteriori indagini per meglio definire la biologia del tumore. Inoltre, abbiamo delucidato
la relazione epistatica che intercorre tra HIF-1α, Wnt e Notch in cellule derivade da
glioblastoma, dimostrando come Wnt regoli la soppressione del Notch pathway nel
microambiente ipossico dei glioblastomi.
7
La terza parte del mio progetto di dottorato si è focalizzata su un tumore cerebellare
pediatrico di origine neuronale classificato come Medulloblastoma (MDB), che si
riscontra essere il più frequente fra i tumori cerebrali pediatrici. Le più recenti ricerche
rivelano che il MDB deriva da cellule staminali del cervelletto che proliferano in
maniera aberrante perdendo il controllo della loro capacità di auto-rinnovamento. E’
stato inoltre riportato che cellule di MDB hanno una elevata attivazione endogena del
Notch signalling, noto per promuovere proliferazione e sopravvivenza delle cellule
staminali neurali neoplastiche e per inibire il loro differenziamento. Se l’interazione fra
HIF-1α e il Notch signalling ha la funzione di mantenere i precursori neurali sani in uno
stato indifferenziato, la loro interazione nelle cellule di MDB non è ancora stata
caratterizzata. In questo studio abbiamo analizzato se l’ipossia, stabilizzando HIF-1α,
modulasse il signalling di Notch1 in cellule primarie derivate da MDB. I nostri risultati
indicano che cellule staminali derivate da MDB richiedono un ambiente ipossico per la
loro espansione in vitro, mentre un’esposizione acuta delle stesse al 20% di ossigeno
induce il differenziamento delle cellule tumorali e la loro morte attraverso l’inibizione
del Notch1. Da notare che attivando Notch1 con il suo ligando DLL4 in condizioni
ipossiche si ha un’espansione di precursori CD133+ e Nestina+ del MDB, suggerendo
un effetto regolatorio di questo pathway sulla sotto-popolazione staminale. Al contrario,
cellule di MDB vanno incontro a differenziamento neuronale quando trattate con un
inibitore della γ-secretase che previene l’attivazione del Notch.
Conclusione: Questi risultati suggeriscono che l’ipossia, attivando il signalling
intracellulare di Notch, preserva le cellule staminali di MDB e ne promuove
l’espansione.
Significato: Con questo lavoro abbiamo cercato di definire la complessa regolazione
che modula il fenotipo delle cellule staminali tumorali e abbiamo contribuito a chiarire
la interrelazione fra i diversi signalling pathway che controllano fenotipo e
comportamento delle cellule derivate da tumore cerebrale.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Basso, Giuseppe
Supervisor:Persano, Luca
Ph.D. course:Ciclo 24 > Scuole 24 > MEDICINA DELLO SVILUPPO E SCIENZE DELLA PROGRAMMAZIONE > EMATOONCOLOGIA, IMMUNOLOGIA E GENETICA
Data di deposito della tesi:27 January 2012
Anno di Pubblicazione:27 January 2012
Key Words:Hypoxia, Glioblastoma, Medulloblastoma, Notch, BMP, Wnt
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/38 Pediatria generale e specialistica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Pediatria
Codice ID:4549
Depositato il:17 Dec 2012 11:00
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Bibliografia

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microenvironment. Elena Rampazzo, Luca Persano, Natascia Tiso, Francesca Pistollato, Cerca con Google

Enrico Moro, Chiara Frasson, Patrizia Porazzi, Alessandro Della Puppa, Silvia Bresolin, Cerca con Google

Geertruy Te Kronnie, Francesco Argenton and Giuseppe Basso Cerca con Google

PLoS One. 2009 Jul 9;4(7):e6206. Cerca con Google

Molecular mechanisms of HIF-1alpha modulation induced by oxygen tension and Cerca con Google

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Nov;28(11):1918-29. doi: 10.1002/stem.518. Interaction of hypoxia-inducible factor-1α Cerca con Google

and Notch signaling regulates medulloblastoma precursor proliferation and fate. Cerca con Google

Pistollato F, Rampazzo E, Persano L, Abbadi S, Frasson C, Denaro L, D'Avella D, Cerca con Google

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