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Villani, Valentina (2012) Evaluation of the therapeutic potential of amniotic fluid stem cells for the treatment of a model of type I diabetes. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Type I diabetes (T1D), also known as diabetes mellitus or juvenile diabetes, is a metabolic disorder characterized by the selective destruction of pancreatic β cells of the islets of Langerhans. This loss, caused by an autoimmune attack of the endocrine cells, leads to hypoinsulinemia and hyperglycemia. T1D has nowadays reached epidemic proportions and the number of patients is rapidly increasing. To date, treatments are limited to administration of exogenous insulin and islets transplantation therapy, whose widespread applicability is though limited by scarcity of donors and risks related to immunosuppressive regimens. Stem cell therapy could represent a reliable treatment in the near future. In the context of regenerative medicine, stem cells have garnered much attention as a new potent source for the treatment of severe pathologies in which a specific tissue is lost or damaged, as in diabetes. Both embryonic and mesenchymal stem cells have been frequently investigated and represent an alternative source of in vitro-differentiated implantable β cells or can be directly used in stem cell therapy treatments. Different studies have already reported the application of mesenchymal stem cell (MSC) therapy for the treatment of autoimmune disease as T1D, showing that tissue protection and repair are obtained primarily via paracrine immunomodulatory functions.
Amniotic fluid represents a new source of pluripotent stem cells. It contains a heterogeneous population of cells originating from the developing fetus, including c-kit positive cells, which exhibit both embryonic and mesenchymal stem cell characteristics. Amniotic fluid stem cells (AFSC) can be easily isolated without causing any harm to the fetus, thus there is no ethical concern in their use, can be extensively expanded in vitro and have the advantage of not forming tumors in vivo. Our laboratory has already demonstrated the successful therapeutic application of AFSC in a murine model of acute and chronic kidney injury as well as in model of acute and chronic lung injury.
The aim of the project was to test the therapeutic potential of AFSC for the treatment of an acute mouse model of T1D. We hypothesize that intracardiac injections of AFSC on diabetic mice have the potential to restore pancreatic functional loss and to protect the pancreatic tissue from further damage.
Our approach was based on the in vivo injection of human AFSC into immunodeficient NOD/SCID mice. Mice were rendered diabetic by selective drug treatment with streptozotocin. Injected mice were divided into two distinct groups, the first one receiving a single cell injection and the second group receiving a double dose of cells. This approach was chosen in order to evaluate whether the effect of stem cells could depend from the frequency of injections. Mice treated with AFSC were compared to not-treated diabetic mice and wild type mice. Mice were constantly monitored for blood glucose levels and in all experimental groups that received AFSC some of the mice maintained normoglycemic values during the time frame of investigation.
Immunohistochemical assays reveal that diabetic mice treated with AFSC had significantly higher levels of insulin when compared to diabetic mice. Moreover, islets from AFSC-treated mice showed morphology similar to that of wild type islets. Integration of AFSC into the target organ was as well evaluated by immunofluorescence. However, despite the presence of some AFSC into the host tissue, the percentage of integrated cells resulted very low. Our hypothesis is that AFSC have the ability to restore pancreas functionality by mainly protecting endogenous beta cells, thus modifying the local microenvironment and/or by stimulating regeneration from endogenous progenitors rather than differentiate themselves into functional beta cells.
In summary, we were able to show that AFSC can hold the potential to treat a severe condition such as diabetes by mainly protecting endogenous cells from damage. However the response to cell treatment is not equal among mice. We speculate that differences in outcomes among the mice can be due mainly to the type of injury that we performed, creating variations between different animals in the early phase of disease development.

Abstract (italian)

Il diabete di tipo I, noto anche come diabete mellito o diabete giovanile, è una malattia metabolica caratterizzata dalla distruzione selettiva delle cellule β che risiedono nelle isole del Langherans del pancreas. Tale perdita, causata da un attacco autoimmune da parte di linfociti T e macrofagi che infiltrano il tessuto endocrino del pancreas, ha come immediata conseguenza lo sviluppo delle condizioni di ipoinsulinemia e relativa iperglicemia.
Ad oggi, il diabete mellito ha raggiunto proporzioni epidemiche ed il numero di persone affette è in rapida espansione. Le attuali terapie per il trattamento del diabete mellito si limitano alla somministrazione d’ insulina esogena e, in alcuni casi, al trapianto di insule pancreatiche da donatore. Entrambe tuttavia presentano alcuni aspetti negativi tra cui la difficoltà nel mantenere sotto stretto controllo costante il livello di glucosio nel sangue, nel caso della terapia insulinica, ed il numero ridotto di donatori disponibili, nonché i rischi legati alle terapie immunosoppressive, per quanto riguarda il trapianto.
Negli anni più recenti, la ricerca nel campo della medicina rigenerativa si è concentrata sulla possibilità di utilizzare le cellule staminali come fonte alternativa per la rigenerazione in vivo o in vitro di cellule che producano insulina e possano rimpiazzarne la perdita negli individui affetti. Sia le cellule staminali embrionali che mesenchimali sono state già analizzate e studiate come fonte alternativa di cellule da cui derivare in vitro beta cellule impiantabili o per un loro utilizzo diretto in trattamenti basati sulla terapia cellulare. Diversi studi hanno già riportato l'applicazione di terapie basate sull'uso di staminali mesenchimali per il trattamento di malattie autoimmuni quali il diabete mellito, dimostrando come la protezione e la riparazione del tessuto si ottengano principalmente mediante funzioni paracrine immunomodulatorie.
Il liquido amniotico rappresenta una fonte nuova e alternativa di cellule staminali pluripotenti in quanto contenente una popolazione eterogenea di cellule che derivano dal feto in via di sviluppo, incluse le cellule positive per il fattore c-kit, le quali rappresentano circa lo 0.8-1 % dell'intera popolazione. Le cellule staminali da liquido amniotico (AFSC), positive per c-kit, possiedono caratteristiche delle cellule staminali embrionali e mesenchimali. L'uso delle AFSC presenta alcuni vantaggi tra cui la facilità di isolamento da campioni di liquido amniotico senza danno per il feto, il che permette di aggirare i problemi etici legati all'uso delle staminali embrionali. Inoltre, le AFSC possono essere espanse in vitro per numerosi passaggi ed è stato dimostrato, mediante la loro applicazione in vivo, che le AFSC non hanno proprietà tumorigeniche. Il potenziale terapeutico delle AFSC nel campo della medicina rigenerativa è già stato dimostrato con successo in modelli murini di danno, acuto e cronico, in rene e polmone.
Lo scopo del progetto è la valutazione del potenziale terapeutico delle AFSC per il trattamento di un modello murino acuto di diabete mellito. L'ipotesi è che le AFSC, iniettate per via intracardiaca in topi diabetici, abbiano il potenziale di proteggere il tessuto pancreatico dal danno e favorire la rigenerazione.
Il nostro approccio si è basato essenzialmente sull'applicazione in vivo di AFSC umane mediante iniezione intracardiaca in topi immunodeficienti NOD/SCID. Il diabete è stato indotto mediante trattamento chimico selettivo con streptozotocina ed i topi sono stati successivamente divisi in due gruppi al fine di valutare l'effetto di una singola iniezione di AFSC o di una doppia iniezione. I topi trattati con AFSC sono stati confrontati con topi diabetici e topi wild type. Gli animali sono stati monitorati ad intervalli di tempo regolari per quanto riguarda il parametro fisiologico del glucosio sanguigno e, al termine dell'esperimento, sacrificati. Solo alcuni dei topi trattati hanno risposto al trattamento con le staminali da liquido amniotico, mantenendo valori normoglicemici pressoché per tutta la durata dell'esperimento. Saggi immunoistochimici hanno permesso di evidenziare che i livelli di insulina di topi trattati con streptozotocina e iniettati con AFSC sono risultati significativamente superiori a quelli dei topi diabetici di controllo. Inoltre, le isole pancreatiche dei topi trattati con AFSC mostrano una morfologia molto simile a quella dei topi wild type. La percentuale di integrazione delle AFSC nel tessuto dell'ospite è risultata piuttosto scarsa, come già emerso in precedenti studi, supportando l'ipotesi secondo cui le AFSC abbiano la capacità di ripristinare la funzionalità pancreatica principalmente mediante protezione delle cellule beta endogene ed eventualmente stimolando la rigenerazione a partire da precursori endogeni piuttosto che per differenziamento diretto.
Con l'approccio in vivo è stato possibile ottenere risultati preliminari promettenti per una futura applicazione di terapia cellulare possibilmente in ambito clinico. Tuttavia, il responso al trattamento non è uguale per tutti gli animali. Ipotizziamo che differenze nella risposta alla terapia cellulare possano dipendere dal tipo di danno acuto indotto, creando variazioni tra i topi nella prima fase di sviluppo della malattia.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Di Liddo, Rosa
Supervisor:Perin, Laura
Ph.D. course:Ciclo 24 > Scuole 24 > BIOLOGIA E MEDICINA DELLA RIGENERAZIONE > INGEGNERIA DEI TESSUTI E DEI TRAPIANTI
Data di deposito della tesi:27 January 2012
Anno di Pubblicazione:27 January 2012
Key Words:Type I diabetes, beta cell regeneration, Amniotic fluid stem cells
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/09 Farmaceutico tecnologico applicativo
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Farmaceutiche
Codice ID:4579
Depositato il:26 Oct 2012 12:51
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