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Di Gangi, Iole Maria (2012) Analisi quantitativa delle dimetilarginine (ADMA ed SDMA) e degli aminoacidi strutturalmente correlati mediante UPLC-ESI-MS/MS nella diagnosi e prognosi di patologie NO-dipendenti correlate allo stress ossidativo nell'ツツ兮dulto e nel bambino. [Tesi di dottorato]

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Documento PDF (Tesi Dottorato Di Gangi IM)
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Abstract (inglese)

Background: Asymmetric dimethylarginine (ADMA), an endogenous nitric oxide (NO) formation inhibitor, has emerged as a promising biomarker of NO-associated endothelial dysfunction in cardiovascular diseases as well in chronic renal failure and pre-eclampsia but only recently this amino acid was associated also to the pathogenesis of some respiratory diseases, such asthma and cystic fibrosis. Although ADMA is an established marker of endothelial dysfunction in adults its biological relevance in the pediatric age is still unclear. Theoretically, due to its interference with nitric oxide (NO) production, ADMA might be involved in the pathogenesis of several disorders originating early in life. Interest has been specially focused on its potential role in neonatal lung biology, as NO is a critical regulator of lung morphogenesis and homeostasis. ADMA has been indicated as a mediator of the physiologically high pulmonary vascular resistance during fetal life, and implicated in the pathogenesis of persistent pulmonary hypertension of the newborn.
Thus, there is considerable demand for a specific, sensitive and rapid method for ADMA and related metabolites for quantitative determination in biological fluids of adults with NO related disorders and preterm newborn involving in clinical study for diagnosis of cardiovascular and pulmonary diseases. The interest in potentially fundamental role of this metabolite, in basic and clinical research, led to the development of numerous analytical methods for the quantitative determination of ADMA and dimethylarginines in biological systems, notably plasma, serum and urine, but not, at the moment, in exhaled breath condensate (EBC), which is a potential rich source for countless biomarkers that can provide valuable information about respiratory as well as systemic diseases. EBC is obtained as breath exhaled from the lungs into a cooled collecting device, thereby condensing the vapor and aerosolized droplets emerging with the breath.
Quantification of ADMA and related metabolites was made by several methods based on HPLC, coupled with fluorescence and mass spectrometric methods such as LCテ「ツツ溺S/MS and GCテ「ツツ溺S, capillary electrophoresis and ELISA.
Moreover to apply the method in pediatric clinical research is very important to have a small volume of sample used for analysis, especially for plasma and serum.
Objectives: The aim of this thesis was finalized to applied the method, created and validated in our laboratory, for simultaneous determination of arginine, ADMA, SDMA, NMMA, homo-arginine and citrulline in plasma samples of healthy adults and patients with different pathologies such as hyperglycemia, heart diseases and pre-eclampsia, and in plasma and serum of term and preterm newborns.
To evaluate if ADMA is detectable in exhaled breath condensate of asthmatic and healthy children, we developed an alternative technique that can enhance our UPLC/MS/MS method in term of sensitivity using large injection volumes enriched online in a trap column that would compensate for the possible dilution effects in EBC samples.
Methods: The method was characterized by simple and rapid preparation, short time analysis, accurate quantification on different biological matrices (plasma, serum and EBC) using stable isotope labeled internal standard and very low amount of sample by Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography (UPLC) run coupled with electrospray ionization (ESI) in the positive mode tandem mass spectrometry detection.
We measured circulating ADMA and related compounds concentrations in a group of very premature newborns at birth and during the first week of life.
We enrolled different type of pathologic populations versus normal populations: adult control group was constituted of 36 healthy subject (18 males and 18 females, medium age 36.5 years) and 15 women in normal pregnancy (medium age of 32 years); and pathologic population was constituted of 15 women with pre-eclamptic pregnancy (medium age of 32 years), 20 subjects with heart diseases (10 males and 10 females, medium age of 75.5 years) and 30 hyperglycemic patients (16 males and 14 females, medium age 71 years). In pediatric field we enrolled a group of 31 extremely low birth weight (ELBW) newborns versus 30 term newborn to evaluate whether ADMA levels correlate with specific perinatal/neonatal risk factors or short-term outcome indicators; and EBC samples from a group of 29 children with asthma 5,8 to 16,3 years old and 62 healthy controls 5,1 to 15,4 years old.
Results and conclusions: In healthy adults plasma and serum we did not found appreciable differences in concentration of ADMA and related metabolites, except for Arg and relative ratio versus ADMA, that appeared higher more than 60% in serum than in plasma. In adult subjects with heart diseases ADMA and SDMA values were respectively of 0.89テつア0.17テつオM and 0.72テつア0.26テつオM, significantly higher than normal controls (p<0.05); hyperglycemic subjects, instead have shown ADMA levels of 0.47テつア0.13テつオM significantly lower (p=0.002) than healthy subjects. There was any significant difference in SDMA concentrations between two studied populations.
We observed that ADMA concentrations are significantly lower in pregnant pre-eclamptic women than in the control group at the time of delivery, but these data have some important limitation, owing to the small number of subjects enrolled and to the possible confounding effects of anti-hypertensive therapy in the pre-eclamptic group.
In ELBW newborns ADMA, NMMA and SDMA concentrations remained stable from delivery to day 7 and were not dependent on gender, gestational age or birth weight. ADMA levels resulted significantly higher in infants born to mothers with histologic chorioamnionitis than in infants delivered for other maternal or fetal indications. We speculate that ADMA might be involved in the complex biological events associated with fetal exposure to chorioamnionitis.
In this thesis, was also developed and validated a sensitive and selective method for the quantification of ADMA, arginine, SDMA, NMMA, citrulline, homo-arginine, tyrosine and nitrotyrosine simultaneously, in human EBC based on UPLCテ「ツツ溺S/MS enrichment technology. Actually, do not exist in literature, any analytical method to detect ADMA and its related compounds in EBC human samples. The assay demonstrated excellent accuracy, precision, linearity and specificity for the intended clinical purpose and a good reproducibility of method of collection, demonstring that it is possible to measure ADMA in exhaled breath condensate.
EBC ADMA values in asthmatic children (median value 2,17 [1,15-3,19] テつオmol/mL) were significantly higher than in healthy children (median value 1,1 [0,7-1,5] テつオmol/mL, p<0,001) and in the asthmatic group ADMA values were significantly correlated with inhaled corticosteroids dosage ICS (p=0,005; r=0,406).
Conclusions: The UPLC-ESI/MS/MS method applied at adult populations with different NO-related endothelial dysfunctions, confirmed data from the literature. The fast run time, the feasibility of high sample throughput and the small amount of sample required make this method very suitable for routine analysis in the clinical setting.
Preliminary data on neonatal and pediatric field, show that this method is a very good analytical tool for study dimethylarginines and their metabolism in healthy and disease conditions, it particularly suitable for future applications in the pediatric medicine. These data focus on ADMA as a biologically active molecule associated to exposure to antenatal inflammation, and we suggest its role deserves further investigation in larger clinical studies or appropriate experimental models.
This was, also, the first study that demonstrates ADMA dosage feasibility in exhaled breath condensate, showing that ADMA is increased in asthma and has a possible role in asthmatic inflammation. Further studies will clarify the role of ADMA as a biomarker of asthmatic inflammation and a possible target for new pharmacological approaches.

Abstract (italiano)

Presupposti: L' ADMA, dimetilarginina asimmetrica, ティ un analogo metilato dell'aminoacido arginina. Essa viene prodotta all'interno delle cellule attraverso processi di metilazione di catene polipeptidiche e rilasciata in circolo dopo proteolisi. L'ADMA compete con l'arginina, precursore necessario per la sintesi dell'ossido nitrico, per il legame con l'enzima ossido nitrico sintetasi (NOS), inibendone cosテャ la sintesi. Lテ「ツツ儂O ティ il piテケ potente vasodilatatore conosciuto, che svolge un ruolo chiave, agendo sul sistema endoteliale, nel mantenimento di una grande varietテツ di meccanismi omeostatici del nostro organismo. E' noto da tempo che l'ADMA, per inibizione della produzione di NO, ティ coinvolta nella patogenesi delle principali disfunzioni indotte da stress ossidativo NO-dipendente a livello cardiovascolare, renale e recentemente anche nell'ambito delle malattie respiratorie come l'asma e la fibrosi cistica, in quanto contribuisce ad aggravare lo stato infiammatorio e l'iperreattivitテツ delle vie aeree.
Analizzando i dati riportati in letteratura, si ティ notato che non vi sono studi longitudinali sulle concentrazioni di ADMA in etテδ neonatale, sia nei soggetti a termine che in quelli prematuri, nテδゥ sono stati ad oggi dosati i livelli di ADMA nel condensato dell'aria espirata, che si ritiene essere un biofluido la cui composizione riflette quella del liquido di superficie delle vie aeree, oltre ad essere caratterizzato dalla non invasivitテツ e la semplicitテツ nell'esecuzione della metodica di prelievo.
Scopo dello studio: il presente lavoro ha avuto in primo luogo lo scopo di applicare il metodo UPLC-ESI-MS/MS messo a punto nel nostro laboratorio, su una popolazione di adulti sani al fine di verificare la validitテツ della metodica, confermando i dati esistenti in letteratura. Si ティ poi passati all'applicazione su soggetti adulti affetti da diverse patologie (iperglicemia, cardiopatie, preeclampsia) per verificarne l'applicabilitテツ in ambito clinico, ed infine ティ stata presa in considerazione la popolazione pediatrica, determinando in maniera longitudinale la concentrazione sierica di ADMA e delle altre arginine metilate (SDMA, NMMA) in un gruppo di neonati a termine in prima e terza giornata di vita e in un gruppo di neonati pretermine di peso neonatale estremamente basso (< 1000 g - ELBW) durante il primo mese di vita.
Per quanto riguarda lo studio delle malattie respiratorie lo scopo ティ stato quello di valutare se l'ADMA ティ dosabile nel condensato dell'aria espirata in bambini affetti da asma in buon controllo, con o senza terapia, confrontati con un gruppo di bambini sani e verificare la riproducibilitテδ della metodica di analisi dell'ADMA sull'EBC.
Materiali e metodi: La determinazione quantitativa ティ stata effettuata attraverso una separazione cromatografica in UPLC e analisi dei campioni mediante uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Le caratteristiche del metodo sono costituite dall'utilizzo di quantitテツ esigue di campione, elevata specificitテツ e sensibilitテツ strumentale.
Per poter ricavare i valori di riferimento della popolazione adulta sono stati arruolati 36 soggetti sani (18 uomini e 18 donne di etテツ media pari a 36.5 anni) come gruppo di controllo rispetto a pazienti con infarto miocardico (20 soggetti di cui 10 uomini e 10 donne di etテツ media pari a 75.5 anni) e diabete di tipo II insulino resistente (30 soggetti di cui 16 uomini e 14 donne di etテツ media pari a 71 anni). Lo studio sulle donne in gravidanza ha previsto l'arruolamento di 15 donne affette da pre-eclampsia confrontate con 15 donne in gravidanza normale (etテツ media 32 anni per entrambi i gruppi). L'applicazione in ambito pediatrico ha infine coinvolto un gruppo di 31 neonati di peso estremamente basso alla nascita (ELBW <1000 grammi) rispetto al gruppo di controllo di 30 neonati sani a termine, e un gruppo di 29 bambini asmatici di etテδ compresa tra 5,8 e 16,3 anni confrontati con i relativi controlli sani (62 bambini di etテツ compresa tra 5,1 e 15,4 anni), di cui ティ stato raccolto il condensato dell'aria espirata.
Risultati: I valori dei diversi metaboliti ottenuti sui soggetti adulti sani hanno confermato i dati riportati in letteratura, mentre nei soggetti cardiopatici le concentrazioni di ADMA ed SDMA sono state rispettivamente pari a 0.89テつア0.17テつオM e 0.72テつア0.26テつオM , risultando entrambi significativamente piテδケ alti rispetto ai controlli sani (p<0.05), a differenza invece dei soggetti iperglicemici che hanno mostrato livelli significativamente inferiori (p=0.002) di ADMA (0.47テつア0.13テつオM) rispetto ai relativi controlli, ma nessuna differenza nelle concentrazioni di SDMA.
Il confronto tra donne gravide sane e con pre-eclampsia, ha invece evidenziato che la concentrazione di ADMA al momento del ricovero ティ stata significativamente piテケ bassa nelle gravide ipertese rispetto alle gravide normotese (p=0.006), contrariamente a quanto riportato in letteratura, mentre a 30 giorni di distanza dal parto la situazione si ティ invertita. Nel gruppo dei neonati a termine, l'ADMA in prima giornata ティ risultata estremamente elevata, all'incirca 2-3 volte maggiore rispetto agli adulti. La sua concentrazione ティ diminuita rapidamente, riducendosi giテツ del 25% in terza giornata di vita. Nei soggetti pretermine di peso estremamente basso il dosaggio di ADMA ティ risultato sensibilmente piテケ basso rispetto ai neonati a termine senza variazioni nel tempo. Considerando insieme i due gruppi di neonati, ティ presente una correlazione significativa tra valori di ADMA in prima ed in terza giornata e l'etテツ gestazionale, nonchテゥ il peso neonatale.
Lo studio condotto sull'EBC ha, infine dimostrato che ティ possibile misurare l'ADMA nel condensato con una buona riproducibilitテツ intrasoggetto a distanza di 24 ore. I valori di ADMA nei bambini asmatici (mediana 2,17 [1,15-3,19] テつオmol/mL) sono risultati significativamente piテδケ elevati rispetto a quelli dei bambini sani (mediana 1,1 [0,7-1,5] テつオmol/mL, p<0,001) evidenziando anche una significativa correlazione dei livelli di questo metabolita con il dosaggio dei farmaci corticosteroidei inalatori ICS (p=0,005; r=0,406) assunti dai soggetti asmatici.
Conclusioni: Il metodo sviluppato in questo studio soddisfa i requisiti analitici di precisione, riproducibilitテツ, specificitテツ, sensibilitテツ e recupero analitico indispensabili per l'impiego in ambito clinico. Esso inoltre puテイ essere facilmente automatizzabile e adatto per il suo impiego su larga scala consentendo l'applicazione in qualitテツ di metodo diagnostico nell'ambito delle patologie da stress ossidativo e disfunzione endoteliale e delle malattie cardiovascolari.
L'uso di una quantitテツ esigua di campione, inoltre ne suggerisce l'impiego per lo studio delle diverse patologie del neonato come la sepsi, l'ipertensione polmonare e lo scompenso cardiaco. Infine, essendo questo il primo studio che dimostra la fattibilitテツ del dosaggio dell'ADMA e dei biomarker di stress ossidativo nel condensato dell'aria espirata, ottenendo risultati concordanti con lavori precedenti che dimostravano un aumento di ADMA nell'asma in altre matrici biologiche, ci sono i presupposti per estendere la casistica per confermare il suo possibile ruolo come biomarker nell'infiammazione asmatica e come possibile target di nuovi approcci farmacologici.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Giordano, Giuseppe
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 24 > Scuole 24 > MEDICINA DELLO SVILUPPO E SCIENZE DELLA PROGRAMMAZIONE > MALATTIE RARE, GENETICA, BIOLOGIA E BIOCHIMICA
Data di deposito della tesi:27 Gennaio 2012
Anno di Pubblicazione:27 Gennaio 2012
Parole chiave (italiano / inglese):ADMA; dimethylarginines; UPLC; tandem mass spectrometry; nitric oxide.
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/12 Biochimica clinica e biologia molecolare clinica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Pediatria
Codice ID:4625
Depositato il:15 Nov 2012 11:36
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